【摘要】 背景刚地弓形虫能够感染几乎所有温血动物，其中包括全球约30％的人口。感染通常为无症状的隐形感染，但是孕期弓形虫感染可能导致流产，死产，以及严重的智力发育低下，视网膜或神经损伤。虽然弓形虫感染引起的出生缺陷可能机制包括结构性损伤，内分泌失调，胎盘组织细胞凋亡增加等几个方面，但目前先天性弓形虫病的关键发病环节和确切机制仍不清楚。弓形虫在宿主细胞可引起双重的凋亡效应。现前的一些研究表明，弓形虫感染的细胞对凋亡刺激信号表现出相对的抵抗性；另一方面，已经发现弓形虫急性感染可诱发CD4+小鼠脾细胞凋亡。研究已经证明，高水平的细胞凋亡、高的死亡率与高毒力弓形虫株感染相关；相比之下，在慢性弓形虫脑炎，只观察到有少数细胞凋亡。因此，细胞凋亡的启动和凋亡的发展程度可能在弓形虫病的发病机制和最终转归中起着关键作用。总之，先天性弓形虫病发病中的重要事件和确切机制仍不清楚。内质网（ER）是细胞内蛋白质合成，折叠和组装的主要细胞器。未折叠或错误折叠蛋白的积累可导致内质网适应性反应，称为未折叠蛋白反应（UPR），最终导致内质网应激（ERS）。越来越多的证据显示，在各种毒性物质，包括活性氧（ROS），化学物质和重金属引起细胞凋亡的调控中，内质网应激起着关键的作用。氧化应激是由于ROS生成和抗氧化能力之间的不平衡，这种应激反应通过多种信号通路引发细胞凋亡，如内质网应激反应和ASK1/JNK的活化。在一些疾病，如糖尿病，镉中毒和神经退行性疾病中，这些病理过程中可同时存在。此外，有越来越多的证据表明，氧化应激在感染诱导的细胞凋亡中起着重要的作用。通常，由于母胎新陈代谢的需要，胎盘线粒体活动和ROS的产生增加，孕期处于轻度氧化应激状态。在孕早期，由于绒毛间隙血流的建立，会在短时间诱发氧化应激；胎盘先承受缺氧，然后缺氧/复氧的过程，机体如果不具备有效的抗氧化防御的能力将可能导致早期流产。妊娠后期，在妊娠并发糖尿病，胎儿宫内生长受限和先兆子痫中可发现滋养层细胞凋亡水平增加，氧化应激水平增加。以往的研究发现，在献血员中，弓形虫感染可导致氧化应激和机体的免疫抑制。正常母胎界面存在Th2免疫偏移现象，这不利于病原体的消除，增加了弓形体病的易感性。因此，弓形虫孕期感染或隐性感染的激活会增加胎盘中的氧化应激，促进细胞凋亡和胎盘损伤，并最终导致比正常生理状态更严重的结果。研究显示在妊娠相关疾病中，氧化应激和细胞凋亡之间存在关联。以往的研究表明，LPS可在多个组织中诱导氧化应激，导致小鼠早产。一些研究发现，滋养细胞可被弓形虫强毒株感染，未感染的细胞会发生凋亡，而不是受感染的细胞；这个现象揭示弓形虫诱导的细胞凋亡并不是由于其在母胎界面的直接作用。目的探讨体内外刚地弓形虫感染对滋养细胞凋亡水平的影响；阐明先天性弓形虫病和弓形虫诱发细胞凋亡的具体机制和关键环节；观察抗氧化剂对弓形虫诱发细胞凋亡的负向调节作用,对胎盘病理损伤的保护作用和作为处理相关疾病的潜在治疗价值。方法（1）本实验首先使用ICR孕鼠建立孕期弓形虫急性感染的小鼠模型。孕鼠被随机分入感染组，抗氧化剂保护组和对照组中。在孕8天和孕9天，抗氧化保护组孕鼠按照100mg/kg的计量被注射NAC。另外，在孕8天，感染组和抗氧化保护组的每只孕鼠经腹腔注射200个速殖子。孕鼠处死后，小心剥离并取出胎盘，称重，按照实验程序，制作细胞悬液或包氏液固定用于组织化学分析，另外，取部分胎盘液氮冻存。提取感染组孕12天小鼠胎盘RNA，采用包含84个氧化应激关键基因芯片对胎盘组织的表达谱进行分析。制作胎盘组织匀浆，按照检测试剂盒操作说明，对MDA, GSH和8-OHdG进行检测。采用实时定量PCR方法，对组织和血液标本的弓形虫含量，以及氧化应激相关分子的表达水平进行检测。（2）分离胎盘滋养细胞，通过抗角蛋白-7和波形蛋白抗体对其性质进行鉴定。体外感染使用，采用Transwell系统。在12孔培养板中，速殖子和胎盘细胞按照1×10~6:1×10~6比例加入上层;分离的胎盘滋养细胞1×10~6，加入下层，37℃培养，按照预定的时间收集细胞。胎盘组织制作的细胞悬液和原代培养的滋养细胞分别收集，通过流式细胞和原位末端标记技术进行细胞凋亡分析。采用荧光定量PCR技术对胎盘组织氧化和内质网应激相关标记物进行mRNA水平进行检测。（3）胎盘组织按照说明匀浆，培养的原代细胞直接加入100μl裂解缓冲液。裂解物经SDS-PAGE电泳，蛋白印记分析GRP78,磷酸化JNK, p38,磷酸化p38, caspase-12和磷酸化ASK1进行检测。为了观察NAC对胎盘滋养细胞凋亡信号和前凋亡通路激活的影响，抗氧化保护组的胎盘组织和培养原代细胞被相应处理，同时进行荧光定量PCR，流式细胞和蛋白印记分析。结果(1)成功建立弓形虫孕期急性感染小鼠模型。在孕8天腹腔注射200个RH速殖子,感染小鼠在孕14后开始出现感染症状，但是多数在孕16天仍然存活。(2)通过PCR芯片分析，和正常对照组相比，感染组胎盘中有27个氧化应激相关基因上调两倍以上，9个基因下调两倍以上。NADPH氧化酶1和谷胱甘肽过氧化酶6上调最为明显,约升高25倍。抗氧化组中上述基因差不多回复到正常对照组的水平。通过定量PCR分析，感染组孕10天和孕12天胎盘没有发现弓形虫感染，但是在14天出现感染的高峰。另外，研究显示感染组在孕12天前可观察到虫血症的出现和GSH水平的下降。GSH水平从正常组的9.29±2.26μM/gprot下降到感染组的4.18±1.54μM/gprot (p<0.01)。严重的氧化应激反应导致脂质和DNA的过氧化,表现为MDA和8-OHdG水平增高；分别从对照组的0.41±0.16μM/gprot和1.77±0.65μg/gprot升高到感染组的0.52±0.23μM/gprot和3.88±0.89μg/gprot (p<0.05). NAC使用有效的减弱了过氧化损伤，特别是在早期阶段。抗氧化保护组中GSH, MDA和8-OHdG分别为9.42±2.40μM/gprot,0.45±0.21μM/gprot和3.42±1.63μg/gprot (p<0.01,0.05and0.05)。(3)原代培养的滋养细胞成无规律的多边形生长,多数细胞(90.5±3.5%)为角蛋白-7阳性,通过流式细胞分析，另外大约有5.1%细胞为巨噬细胞。另外，用抗波形蛋白抗体检测为阴性，表明培养细胞中没有成纤维细胞存在。弓形虫感染导致胎盘滋养细胞的凋亡水平明显增加，总凋亡率，早期凋亡率和晚期凋亡率分别从正常对照组的11.04±0.91%,9.77±0.99%和1.27±0.43%上升到60.71±16.96%,38.57±14.66%和22.14±3.20%。和感染组相比，用NAC预处理可以明显降低凋亡水平，总凋亡率为40.28±8.96%,(p<0.05),晚期凋亡下降更为明显，为4.71±2.81%(p<0.05)。上述结论，被胎盘原位凋亡检测进一步证实。(4)通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析，我们发现感染组中，内质网应激标记物，如GRP78, CHOP和caspase-12, JNK/ASK1信号上调或激活; NAC预处理可抑制上述基因的表达或信号通路的激活。本研究中，没有发现p38的上调或活化。结论(1)通过在孕8天经腹腔注射200个RH速殖子的方法，我们成功建立了孕期弓形虫急性感染小鼠模型。(2)孕期感染RH弓形虫速殖子导致氧化应激的爆发，最后引起滋养细胞凋亡水平的升高。(3)在急性RH弓形虫感染情况下，胎盘滋养细胞出现凋亡，其主要经ROS介导的内质网应激，并通过caspase12, CHOP和JNK通路的活化所启动。(4)抗氧化剂可能对防止弓形虫感染所导致的胎盘病理性损伤和滋养细胞凋亡有一定的保护效应。 

 

【关键词】 弓形虫病； 氧化应激； 内质网应激； 细胞凋亡； 发育毒性；