|
整合素alpha5beta1 在纤维粘连蛋白碎片诱 导髓核细胞退变过程中作用的研究# 夏茂盛，朱悦* （中国医科大学附属第一医院） 摘要：目的:研究整合素alpha5beta1 在纤维黏连蛋白碎片诱导间盘髓核细胞退变过程中的作 用。方法:体外培养间盘髓核细胞，通过RNA 干扰技术特异性抑制整合素alpha5 和beta1 亚 基的表达，在培养液内加入纤维黏连蛋白碎片，通过免疫印迹技术和逆转录聚合酶链式反应 （RT-PCR）的方法，检测II 型胶原蛋白、基质金属蛋白酶9 和13 的表达。结果:特异性抑 制整合素alpha5beta1 表达后，纤维黏连蛋白碎片诱导髓核细胞退变的作用消失，II 型胶原 蛋白、基质金属蛋白酶9 和13 的表达没有变化。结论:整合素alpha5beta1 是纤维黏连蛋白 碎片在髓核细胞上的特异性受体。 关键词：髓核细胞；纤维黏连蛋白碎片；整合素；II 型胶原蛋白；基质金属蛋白酶 中图分类号：R686.5 The Function of Integrin alpha5beta1 in the Process of Fibronectin Fragments Degeneration Nucleus Pulposus Cells XIA Maosheng, ZHU Yue (The First Hospital of China Medical University) Abstract: Objective:To determine the function of integrin alpha5beta1 during the process of fibronectin fragments (Fn-f) degeneration nucleus pulposus (NP) cells. Methods The expression of integrin alpha5beta1 was specifical silenced by siRNA after the nucleus pulposus cells were separated and cultured. Then the Fn-f were added to the culture solution of NP cells, the expression of the matrix metalloproteinase 9 (MMP9), MMP13 and collagen II were determined by reverse transcription polymerase chain reaction and immunoblotting. Results After the expression of integrin alpha5beta1 was silenced in NP cells, the expression of MMP9, MMP13, and collagen II had no difference with control under the treatment of Fn-f. Conclusion Integrin alpha5beta1 was the special receptor of Fn-f on NP cells. Key words: nucleus pulposus cells; fibronectin fragments; integrin; collagen II; matrix metalloproteinases 0 引言 纤维黏连蛋白碎片(fibronectin fragments, Fn-f)是纤维黏连蛋白（fibronectin） 的分解产物，其是一种间盘退变产物，同时又具有诱导间盘退变的作用[1,2]。在我们的前期 研究中证明Fn-f可以增加基质金属蛋白酶9和13（MMP9，13）在髓核细胞的表达，降低II型 胶原蛋白的表达，这说明Fn-f可以诱导髓核细胞退变，而且我们同样发现Fn-f可以增加整合 素.5.1在髓核细胞上的表达[3]。而整合素.5.1、.v.1和.v.3等是纤维黏连蛋白在细胞膜上主 要的受体[4,5]。已有文献证明整合素.1、.5、.v和.1、.3均在间盘内表达[6]，因此，本研究探 讨整合素.5.1在Fn-f诱导髓核细胞退变过程中的作用，即Fn-f是否特异性通过整合素.5.1受 体诱导髓核细胞退变。 基金项目：博士点新教师基金（20102104120002）；辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2011135）；中国 医科大学附属第一医院科学研究基金(fsfh1102) 作者简介：夏茂盛（1981-），男，副教授，主要研究方向：脊柱外科. E-mail: xiamaosheng1981@163.com 1 材料与方法 1.1 材料 动物为日本大耳白兔，3 月龄，8 只，质量2500±200 g；试剂为纤维黏连蛋白碎片 （110-kDa,Sigma）、用于免疫沉淀的整合素.5 和.1 亚基抗体和蛋白G 琼脂糖小球（upstate biotechnology）、用于Western blot 的鼠抗整合素.5、.1、II 型胶原蛋白、MMP9 和MMP13 的单克隆抗体（Santa Cruz），用于基因敲除的siRNA 片段（Santa Cruz Biotechnology）。 1.2 方法 1.2.1 细胞的分离和培养 无菌取出兔间盘髓核组织，0.2%的胶原酶消化4 h，用D-Hanks 进行酶液清洗3 次。然 后用培养液DMEM/F12+15%胎牛血清重悬细胞，以2×104 /cm2 接种于培养皿内，置于37 ℃5%CO2 条件下培养。约6～7 d 后，待细胞贴壁完全第1 次换液，以后隔2～3 d 换液，细 胞生长到80%融合后，用0.25%胰酶消化传代，传代到第三代。 1.2.2 基因敲除 进行敲除的前一天，将第三代髓核细胞接种于24孔板上，细胞浓度为3×104 /cm2。转染 液包括2 ml Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)，40 ml Opti-MEMI (Invitrogen)和2.5 ml (4 nM) siRNA，转染时间为8h。在siRNA（-）组不加入siRNA片段，转染后96小时，通过免 疫印迹技术和RT-PCR检测整合素.5.1 的表达情况。 然后将培养液去除，实验组加入含有Fn-f 的无血清DMEM/F12 培养液，Fn-f 的浓度为 100 nmol/L，对照组则只加入无血清DMEM/F12 培养液，37 ℃5%CO2 条件下培养2 d。 1.2.3 Western 免疫印迹 培养2 d 后，去除培养液，加入裂解液，收集细胞裂解液，用Bradford 法测各个样品蛋 白含量。确认转染效率比较两组间整合素.5 和.1 含量的不同，取siRNA（+）和siRNA（-） 样品各1 000 .g 加入8 .g 抗-整合素亚型（.5 或.1）的抗体，4 °C 孵育12 h。然后向样品中 加入200 .l 蛋白G 琼脂糖小球，4 °C 孵育2 h。离心（14 000 g, 5 s）收集琼脂糖小球，并 在沸水中煮5 min。取上清加入准备好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离样品。而比 较II 型胶原蛋白、MMP9、MMP13 在两组间含量的不同时，样品蛋白含量定量后，每组样 品取的蛋白量一致，均为50 .g，直接将样品加入准备好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电 泳分离样品。以后实验步骤相同，电泳分离样品后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。封闭后， 在膜上分别加入鼠整合素亚型（.5、.1）、II 型胶原蛋白、MMP9 和MMP13 的特异性一抗， 1×1000 稀释，孵育2 h。洗膜1 h 后，加入羊抗鼠的二抗，辣根过氧化物酶标记，1×2000 稀释，孵育2 h。最后纤维素膜用ECL 底物显影到胶片上，以.-actin 为内参，结果用图像 分析软件进行分析。 1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 将细胞裂解后，应用Trizol 等提取总核糖核酸（RNA）。用TAKARA 试剂盒，将提取 的RNA 逆转录为cDNA, 在进行PCR 扩增，引物见表1。反应条件是94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35 个循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，分离PCR 扩增 产物。经紫外分光仪比较PCR 产物的含量。 1.3 统计学分析 实验结果采用SPSS 12.0 统计软件进行分析，多样本间方差分析，以P<0.05 为差异有 统计学意义。 2 结果 2.1 抑制整合素.5.1 的表达 转染后整合素.5 和.1 亚基的表达明显被抑制，无论在基因水平还是在蛋白水平，siRNA （+）组的整合素.5 和.1 表达明显降低，与对照组比较有统计学意义（P<0.05，图1）。 2.2 Fn-f 对于抑制整合素.5 和.1 表达的髓核细胞的作用 在抑制整合素.5 和.1 亚基表达髓核细胞的培养液中加入Fn-f，发现MMP9、MMP13 和II 型胶原蛋白表达没有明显变化，与对照组相比不具有统计学意义（图2）。而在siRNA （-）组，Fn-f 同样有增加MMP9 和MMP13 表达，抑制II 型胶原蛋白表达的作用（图2）。 这说明Fn-f 通过整合素.5.1 诱导髓核细胞退变。 图1 转染后整合素.5和.1亚基的表达明显降低。图A为PCR的结果，图B为Western 的结果，转染后siRNA(+) 组整合素的表达明显被抑制。 整合素.5 整合素.. .-actin siRNA（+） siRNA（-） 整合素.5 整合素.. .-actin A B siRNA（+） siRNA（-） 图2 Fn-f 对于抑制整合素.5 和.1 表达的髓核细胞的作用。图A 为PCR 的结果，可以发现在siRNA(+)组内 加入Fn-f 后，MMP9、MMP13、II 型胶原蛋白的基因表达没有变化。图B 为Western 的结果，在siRNA(+) 组内加入Fn-f 后，MMP9、MMP13、II 型胶原蛋白的蛋白表达没有变化。 表1 用于RT-PCR 的引物序列 Table 1 Primers sequence used for RT-PCR of mRNA. 对照 Fn-f siRNA (+) 对照Fn-f siRNA (-) 对照Fn-f 对照 Fn-f siRNA (-) siRNA (+) 对照 Fn-f 对照Fn-f siRNA (-) siRNA (+) 对照组 Fn-f siRNA (-) 对照组 Fn-f siRNA (+) MMP9 MMP13 II 型胶原蛋白 .-actin A1 0 1 2 3 4 以.-actin 为内参 对照组 Fn-f siRNA (-) 对照组 Fn-f siRNA (+) MMP131 II 型胶原蛋白 .-actin B1 MMP9 0 1 2 对照Fn-f 对照Fn-f siRNA (-) siRNA (+) 对照Fn-f 对照 Fn-f siRNA (-) siRNA (+) 对照 Fn-f 对照Fn-f siRNA (-) siRNA (+) B2 MMP9 MMP131 II 型胶原蛋白 * * * 以.-actin 为内参 MMP9 MMP131 II型胶原蛋白 A2 * * * Fwd AACGAGGATGATGATTTGGTCCG Rev TTGGCCAGGAGGAAAAGCGTGAG 505 bp Gene Primers Length .-actin Fwd GCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCT Rev GTGATGACCTGGCCGTCAGGCAGC 227 bp Collagen II Fwd GGAAACTTTGCTGCCCAGATG Rev TCACCAGGTTCACCAGGATTGC 205 bp MMP9 Fwd TTGGTGGTCTTCCCAGGAGAG Rev GCAGGTCTTCGGAGTAGTTTTGG 316 bp MMP13 Integrin .5 Fwd GGCAGCTATGGCGTCCCACTGTGG Rev GGCATCAGAGGTGGCTGGAGGCTT 171 bp Integrin .1 Fwd GTGGTTGCTGGAATTGTTCTTATT Rev TTTTCCCTCATACTTCGGATTGAC 189 bp 3 讨论 本实验发现，Fn-f 可以诱导间盘髓核细胞退变，但是当抑制整合素.5 和.1 亚基表达后， Fn-f 对于髓核细胞的作用消失，即Fn-f 对于髓核细胞MMP 和II 型胶原蛋白的表达没有影 响，这说明Fn-f 诱导髓核细胞退变的作用需要整合素.5 和.1。 Fn-f 是间盘退变过程中纤维黏连蛋白的分解产物，其含量在退变间盘内的含量明显增 加。有文献已经证明了Fn-f 有减少糖蛋白表达，促进基质蛋白分解的作用[1，2]。而且在我们 前期实验中同样证明了这个结论，Fn-f 减少了II 型胶原蛋白的表达，增加了MMP9 和MMP13 的表达。并且我们进一步发现Fn-f 可以增加整合素.5 和.1 在髓核细胞亚基的表达。 整合素是一组细胞表面的黏附分子，是多种基质蛋白的膜受体，其可以参与细胞的信号 传导，调控基因表达、细胞周期和细胞凋亡[7]。研究表明整合素.1，.5，.v，.1，.3 在正常 人间盘组织内表达[6]。整合素可以与间盘内多种基质蛋白相互作用，如.1.1、.2.1 亚单位是 胶原蛋白在间盘细胞膜上的主要受体，而.5.1、.v.1 和.v.3 亚单位是纤维黏连蛋白的膜受体 [4，5]。那么在Fn-f 诱导髓核细胞退变的过程中是何种受体起了主要作用呢？Fn-f 可以增加整 合素.5 和.1 的表达，那么整合素.5.1 是否在这个过程中起主要作用。因此，我们进行了本 次实验，特异性抑制整合素.5.1 的表达，再观察Fn-f 的作用，发现髓核细胞的蛋白表达没 有变化，这说明正是整合素.5.1 在Fn-f 诱导髓核细胞退变的过程中发挥了主要作用。 在研究Fn-f 的退变机制时，Homandberg 提出Fn-f 增加了MMP 的表达，增加的MMP 分解纤维黏连蛋白形成更多的Fn-f，而II 型胶原蛋白的表达减少是这个恶性循环的最终结 学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
