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性不育的遗传学诊断。Li 等分别通过cfsDNA 和血液白细胞DNA 对36 例无精子症患者Y 125 染色体微缺失进行诊断，发现其诊断结果完全一致[7]。表明cfsDNA 可作为无精子症患者Y 染色体微缺失无创诊断的备选途径。最近，我们课题组筛查并比较了生精功能正常与输精管 结扎成年男性cfsDNA 的DNA 甲基化谱，发现134 个睾丸和附睾特异性高甲基化启动子和 367 个睾丸和附睾特异性低甲基化启动子，并通过DNA 甲基化免疫沉淀和荧光定量PCR 结 合的方法对芯片结果进行了验证，证实了结果的可靠性（数据待发表）。这一发现，为男性 130 不育和生殖肿瘤的诊断及研究提供了新方向。 4 cfsDNA 的应用前景 同传统的使用生殖器官活检或穿刺进行男性不育、生殖肿瘤诊断和研究相比，cfsDNA 在男性不育、生殖肿瘤诊断和研究方面有不可取代的诸多优势：①收集精液标本具有无创性， 患者易于接受，利于cfsDNA 标本获取；②由于血-睾屏障及血-附睾屏障存在，保证cfsDNA 135 只来源于睾丸、附睾、前列腺和精囊腺等男性生殖器官，DNA 序列和表观遗传信息特异性 强；③cfsDNA 能更全面反映双侧睾丸和附睾的遗传及表观遗传信息，避免活检或穿刺时组 织异质性的问题；④cfsDNA 浓度高，能用于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、实时定量 甲基化PCR 和DNA 甲基化芯片等分子生物学技术研究。 目前，全球约有10-15%不育夫妇，其中50％与男方因素有关[19]。除了感染、内分泌、 140 免疫、遗传、先天畸形及精索静脉曲张等病因外，有50％男性不育病因不清楚，被诊断为 特发性不育[20]。其中，大部分被认为与未知遗传因素有关。由于睾丸活检或穿刺对生精小 管有一定损伤，且有出现感染、血肿等并发症的风险，因此，取材受限影响了特发性不育病 因的研究；而且，不同部位睾丸组织的异质性也给特发性不育诊断带来一定偏差[21]，影响 治疗方案制定。尽管可通过卵细胞胞浆内单精子注射技术使一些特发性不育男性获取自己下 145 一代，但是增加了将异常基因序列及异常父源印记基因遗传给下一代的风险。临床上，男方 遗传学筛查主要是通过外周血白细胞检测Y 染色体长臂无精子因子区域微缺失来判断男性 不育原因，对男性生殖细胞表观遗传学改变尚无有效筛查方法。通过精浆无创获取睾丸生殖 细胞DNA 表观遗传信息的途径将会为男性特发性不育诊断、病因研究和辅助生殖技术表观 遗传风险预测提供新途径，为不育患者治疗提供依据。 150 有研究报道，睾丸生殖细胞肿瘤患者睾丸组织DNA 有一定表观遗传学改变，而这些表 观遗传学改变与精原细胞瘤和非精原生殖细胞瘤等病理类型紧密相关[22]。最近，Brait 等发 现精原细胞瘤、非精原生殖细胞瘤组织和正常睾丸组织差异性甲基化启动子标记物，使用这 些标记物联合诊断精原细胞瘤和非精原生殖细胞瘤的敏感性和特异性分别为81.4-85.7%和 78.3-82.6%, 鉴别精原细胞瘤和非精原生殖细胞瘤的敏感性和特异性分别为85.7%和 155 93.0%[23]。另外，睾丸组织获取困难限制了睾丸生殖细胞肿瘤的临床早期筛查诊断，不同部 位睾丸组织异质性使睾丸生殖细胞肿瘤病理类型诊断出现一定困难，影响肿瘤治疗。目前， 在睾丸生殖细胞肿瘤患者精浆中发现了胎儿生殖细胞特异性蛋白标记物AP-2γ 和 OCT-3/4[24]，表明睾丸肿瘤细胞的物质能释放到精浆。据此推测，通过cfsDNA 能全面获取 双侧睾丸肿瘤细胞表观遗传信息，利用精浆睾丸生殖细胞肿瘤差异性甲基化启动子标记物可 160 进行肿瘤的无创诊断和研究，从而解决早期筛查诊断中组织取材限制和病理类型诊断不准确 等问题。在前列腺癌患者中，血液cfDNA 启动子甲基化标记物已用于前列腺癌诊断和预后 评估研究[25, 26]，而前列腺上皮细胞DNA 会以前列腺小体形式分泌到精浆中[6]，所以cfsDNA 将为前列腺癌早期诊断、疗效监测和预后评估无创研究提供另一有效途径。 5 结论与展望 165 在cfDNA 一般特征和生物学功能中，cfDNA 产生机制及基因组转移功能有待进一步研 究。在男性生殖系统疾病中，cfsDNA 的独特优势使男性特发性不育无创诊断和病因研究成 为可能，也为睾丸生殖细胞肿瘤及前列腺癌早期诊断、疗效监测和预后评估的无创研究提供 了新途径。随着cfsDNA 中睾丸、附睾、前列腺和精囊腺等器官特异性表观遗传信息的发现， 将会为男性特发性不育诊断、病因学研究和睾丸生殖细胞肿瘤、前列腺癌的早期诊断、疗效 170 监测和预后评估的无创研究提供广阔前景。 [参考文献] (References) [1] Agostini M, Enzo M V, Bedin C, et al. 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