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雷帕霉素联合地塞米松抑制mTOR/p70S6K 通路逆转Raji 细胞对雷帕霉素和糖皮质激 素耐药的研究# 5 顾玲，张妍乐，唐红霞，马志贵* 基金项目：教育部高等学校博士点新教师基金（20090181120115） 作者简介：顾玲，（1973-），女，副研究员，血液肿瘤分子发病机制。E-mail: guling00@163.com （四川大学华西第二医院儿童血液科，血液肿瘤研究室，成都 610041） 摘要：目的 以Burkitt 淋巴瘤Raji 细胞株为研究对象，探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR） 信号通路与糖皮质激素耐药的关系及机制。 方法 用mTOR 抑制剂雷帕霉素和/或地塞米松 处理Raji 细胞，MTT 法检测药物对细胞增殖的影响；Annexin V/ PI 染色法检测细胞凋亡； 10 PI 染色法检测细胞周期改变；Western blot 法分析mTOR 以及周期、凋亡相关蛋白表达的改 变。 结果 Raji 细胞缺失mTOR 信号传导通路下游蛋白4E-BP1 表达，因此不伴4E-BP1 的活化，伴p-p70S6K 通路活化。单用雷帕霉素或地塞米松不能有效抑制p-p70S6K 表达， 对细胞生长亦无明显影响。两药联合应用可抑制p-p70S6K 表达，高效抑制Raji 细胞生长， 逆转其对GC 和雷帕霉素的耐药。其分子机制是雷帕霉素和GC 协同上调细胞周期调控蛋白 15 p21waf1 和p27kip1 的表达，下调cyclin D1 和cyclin A 表达，使细胞停滞于G1 期；同时协 同诱导促凋亡蛋白Bax 和Bim 表达，并下调抑凋亡蛋白Mcl-1 表达，从而激活caspase-3， 诱发肿瘤细胞凋亡。 结论 mTOR 激酶激抑制剂雷帕霉素联合地塞米松能同时逆转Raji 细 胞对雷帕霉素和糖皮质激素耐药。 关键词：糖皮质激素；耐药；Raji；mTOR；雷帕霉素 20 中图分类号：R733 Rapamycin Combined Dexamethasone Reverse Rapamycin and Glucocorticoid Resistance in Raji Cells by Inhibiting mTOR/p70S6K Pathway 25 GU Ling, ZHANG Yanle, TANG Hongxia, MA Zhigui (Laboratory of Hematology/Oncology, Department of Pediatric Hematogly, West China Second University Hospital, Sichuan University, ChengDu 610041) Abstract: Objectives. To investigate the relationship of mTOR pathway and glucocorticoid (GC) resistant in Raji cells and it’s mechanisms. Methods. Cell proliferation was detected by MTT test. 30 Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis was used to analyze apoptosis and cell cycles. Western analysis was performed to test the expression of the downstream effecter proteins of mTOR, the cell cycle regulatory proteins and apoptosis associated proteins. Results. Raji cells, with 4E-BP1 null and activation of mTOR/p70S6K signalling pathway, are resistant to rapamycin (Rap) and dexamethasone (Dex). Rap and Dex can inhibit growth of Raji cells synergistically 35 (CDI=0.75). Dex or Rap alone can not inhibit the expression of p-p70S6K, co-treatment of Rap with Dex can dominantly downregulate the expression of p-p70S6K, and then reverse GC and Rap resistance. Combined treatment can induce the expression of CDK inhibitors of p21 and p27 and down-regulate the expression of Cyclin A and Cyclin D1, that lead to G0/ G1 arrest. At the same time, Rap enhanced GC-induced apoptosis throug synergistically up-regulation of pro-apoptotic 40 proteins like caspase-3, Bax and Bim and down-regualation of anti-apoptotic protein of Mcl-1. Conclusion. Rap combined with Dex can effectively reverse Rap and GC resistance in Raji cells. Keywords: glucocorticoid; resistance; Raji; mTOR; rapamycin 0 引言 45 糖皮质激素（Glucocorticoids，GC）能特异性的诱导恶性淋巴母细胞增殖停滞并促发其 凋亡[1]，长期以来一直作为治疗淋巴细胞肿瘤疾病的首选药物。GC 耐药是导致淋巴细胞肿 瘤性疾病化疗失败的重要原因，遗憾的是，目前尚未找到有效的方法逆转GC 耐药。因此深 入探讨GC 耐药的分子机制，找到有效逆转耐药的方法将大大提高患者的预后。我们最近的 研究提示，与间变型大细胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma, ALCL）发病相关的 50 癌蛋白，NPM-ALK（nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase）激酶，在体外不仅能使 细胞发生肿瘤性转化，还能诱导淋巴肿瘤细胞对GC 产生耐药，其分子机制与激活mTOR （mammalian target of rapamycin）信号路径有关；我们用mTOR 激酶抑制剂雷帕霉素和 GC 共处理表达NPM-ALK 的淋巴瘤细胞，48 小时后细胞明显发生凋亡，强烈提示mTOR 路径在 GC 耐药中可能发挥着重要作用[2,3]。进一步研究发现雷帕霉素也能逆转T-ALL 细胞株GC 耐 55 药[4]。令人意外的是，GC 和雷帕霉素联合用药对Raji 细胞也有很强的生长抑制作用，Raji 细胞是对GC 和雷帕霉素均耐药的Burkitt 淋巴瘤（Burkitt Lymphoma， BL）细胞株，本文 以Raji 细胞为研究对象，试图用mTOR 抑制剂雷帕霉素逆转GC 耐药并探讨其机制。 1 材料和方法 1.1 细胞系 60 GC 耐药BL 细胞株Raji，t(8;14)，本实验室保存。 1.2 试剂 雷帕霉素，为Calbiochem 公司产品；DMSO 为Sigma 公司产品； RPMI-1640 培养基、 小牛血清为Hyclone 公司产品；四甲基偶氮唑蓝盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、Propidium Iodide (PI)染液为Sigma 公司产品；Annexin V-FITC/ 65 PI 凋亡检测试剂盒为KeyGene 公司产品。phospho-4E-BP1、phospho-p70S6K、cyclin D1、 p27kip1、Bax、Bcl-2 抗体购自Cell Signaling Technology 公司；Bim、Mcl-1、cyclin A、caspase-3、 HRP 标记羊抗兔IgG、HRP 标记羊抗鼠IgG 抗体购自Santa Cruz 公司；p21waf1 购自BD 公 司；内参β-actin 抗体购自上海康成公司。 1.3 实验方法 70 1.3.1 细胞培养及实验处理 细胞株使用含10%FBS 的RPMI-1640 培养基；在37℃、5% CO2 孵箱中常规培养。取 对数生长期的细胞株，用RPMI-1640 培养基洗涤2 次，以2×105/ml 细胞密度接种于培养瓶 和96 孔板（每组设3 复孔），重复3 次。 雷帕霉素和地塞米松协同作用实验分4 组：Rap 组，雷帕霉素先用DMSO 溶解，使终 75 浓度为10nmol/L（DMSO 的浓度为5/100,000）；Dex 组，地塞米松先用无水乙醇溶解，使 终浓度为1μmol/L（乙醇的浓度为1/10,000）；Rap+Dex 组，同时加入10nmol/L 雷帕霉素和 1μmol/L 地塞米松；对照组，加入终浓度为5/100,000 的DMSO 和1/10,000 的乙醇。 1.3.2 MTT 法检测细胞增殖 用同批次10%FBS 的RPMI-1640 培养基（不种细胞）做空白对照，作用时间48h，加 80 入20μl MTT（5mg/ml），孵育4h，用酸化SDS 液充分溶解结晶，应用酶标仪于波长570nm 处测定每孔的吸光度（A570）值。（1-实验组A570/对照组A570）即为相对生长抑制率。 采用两药相互作用系数( coefficient of drug inter-action，CDI) 评价两药相互作用。CDI 按下列公式计算: CDI = AB /AⅹB。用吸光度值进行计算，AB 是两药联合组与对照组的比 值，A、B 是各药单独使用组与对照组的比值。如CDI ＜ 1，证明两药作用性质为协同。 85 1.3.3 PI 染色法检测细胞周期 收获1×106 细胞，4℃预冷PBS 洗2 次；4℃ 70% 乙醇固定过夜；4℃ PBS 洗2 次，PI 室温避光染色30 min；流式细胞仪检测细胞的G1/G0、S 及G2/M 期的比率。 1.3.4 Annexin V/PI 染色法检测细胞凋亡 收获3×105 细胞至离心管中，PBS 洗2 次；加入结合缓冲液 500ul，AnnexinV 及PI 染 90 液各5μl，避光15 min；流式细胞仪检测细胞的凋亡。 1.3.5 Western blot 测定蛋白的表达 收获细胞，4℃ 预冷PBS 液洗2 次，Laemmli 蛋白裂解液（Bio-Rad Laboratories）尽 量完全裂解细胞；煮沸5 min；室温冷却后，13,000×g 离心1min；取蛋白上样进行SDS 聚 丙烯酰胺凝胶电泳，电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF 膜上，加入封闭缓冲液 95 室温振荡2h，依次孵育一抗、二抗，化学发光法曝光显色。 1.4 统计学处理 用SPSS12.0 统计软件进行统计学处理。实验数据用均数±标准差（x±s）表示，样本均 数的比较用one-way ANOVA 分析。 2 结果 100 2.1 雷帕霉素和地塞米松协同作用抑制 Raji 细胞生长 Raji 细胞呈现明显的GC 和雷帕霉素耐药特性，用不同浓度地塞米松和雷帕霉素处理 Raji 细胞48h，当地塞米松高达100μmol/L 时，细胞生长抑制率约24%；雷帕霉素浓度高达 1000nmol/L 时，细胞生长抑制率约46%。采用细胞实验用的常规剂量1μmol/L 地塞米松和 10nmol/L 雷帕霉素分别作用48h，细胞生长抑制率约8%和 14%；两药联合作用48h，细胞 105 生长明显受抑，生长抑制率为40%，与对照组、Rap 组、Dex 组相比，P<0.01（图1）。计 算联合用药的CDI 值为0.75，＜1，证实雷帕霉素和地塞米松可协同作用抑制Raji 细胞生长。 同时，联合用药后Raji 细胞体积变小，成团生长的数量和大小减少。 0 30 60 90 120 Raji Cell growth (% of control) Rap group Dex group Rap+dex group* Control group 图1 雷帕霉素和/或地塞米松对Raji细胞生长的影响 110 Fig 1 Growth inhibition of rapamycin and dexamethasone on Raji cells *：Rap+Dex group vs Rap group, Dex group, Control group， P<0.01 2.2 雷帕霉素和/或地塞米松对Raji 细胞周期的影响 雷帕霉素和/或地塞米松对各细胞株作用48h，流式检测各组细胞的细胞周期。雷帕霉素 单独作用对Raji 细胞周期无明显影响，联合地塞米松，细胞增殖明显受抑，G1 期达对照组 115 的1.8 倍（图2A）。进一步检测周期相关蛋白表达，发现：雷帕霉素和地塞米松联合作用 48h，对p21waf1 表达无明显影响，但明显上调p27kip1 蛋白表达明显增加，并下调Cyclin A 和 Cyclin D1 表达（图2B） 图2 雷帕霉素和/或地塞米松对Raji 细胞周期及其相关蛋白的影响 120 （A：雷帕霉素联合地塞米松阻滞细胞周期在G1 期；B：雷帕霉素联合地塞米松对细胞周期相关蛋白的影 响） Fig 2 The effect of rapamycin and dexamethasone on cell cycles and cell cycle regulatory proteins in Raji cells (A: Rapamycin combined with dexamethasone induce G1 phase cell cycle arrest in Raji cells; B: The effect of rapamycin and dexamethasone on cell cycles regulatory proteins in Raji cells) 125 *：Rap+Dex group vs Rap group, Dex group, Control group， P<0.01 2.3 雷帕霉素和/或地塞米松对Raji 细胞凋亡的影响 雷帕霉素和/或地塞米松作用Raji 细胞48h，流式检测细胞早期调亡率，见图3A。雷帕 霉素或地塞米松单独用药没有明显促凋亡作用，联合使用明显诱导细胞早期凋亡，其凋亡细 130 胞百分率达对照组的6.5 倍。进一步检测凋亡相关蛋白表达，联合用药使Bim-EL 表达明显 上调，并裂解Bcl-2，Mcl-1 表达稍有下降，对Bax 无明显影响，明显激活caspase 3（图3B）。 图3 雷帕霉素和/或地塞米松对Raji 细胞凋亡及其相关蛋白的影响 （A：雷帕霉素联合地塞米松诱导细胞凋亡；B：雷帕霉素联合地塞米松对细胞凋亡相关蛋白的影响） 学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
