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Fig.5 B Immunocytochemistry of Xenopus oocyte slices expressing Kir2.3 (400×) 145 Fig.5 Immunocytochemistry of Xenopus oocyte slices expressing Kir2.3 and FLAG-Kir2.3 A.B: Immunocytochemistry. A: The brown precipitating particles can be seen aggregating on the plasma membrane of Xenopus laevis oocyte expressing FLAG-Kir2.3 channel protein. B: No precipitating particles was seen on the plasma membrane of Xenopus oocyte expressing Kir2.3 channel protein. 150 3 讨论 DNA 重组技术是一项复杂庞大的系统工程，简单地说，它包括四个大的步骤：目的基 因的获得；目的基因与载体的体外重组；重组后的DNA 分子导入受体细胞；转化细胞的筛 选和外源基因的表达。抗原表位标记是一项很有用的技术，可以鉴定未经纯化的感兴趣的蛋 白，能够使用经过很好的鉴定和高度特异性的抗体来研究感兴趣的蛋白，不用经长时间费力 155 的过程来生产和鉴定抗体，还不一定能够得到。多项研究表明大多数蛋白可以在一端或其它 区域接受标记物，不严重丧失功能。但应尽量把表位标记物加在靶蛋白的氨基或羧基末端， 这样最可能接近抗体，而最不可能干扰靶蛋白的功能。FLAG 是常用的抗原表位标记物，可 以通过蛋白酶水解切割从靶蛋白中除去，当把FLAG 序列加在靶蛋白的氨基末端，需要在 其碱基序列前加起始密码子ATG。FLAG 作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互 160 作用并且不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利于研究人员对融合蛋白进行下游研究， 现FLAG 标签已广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领 域。虽然现在商品化带有FLAG 标签的真核表达载体很多，但本实验需要在非洲爪蟾卵母 细胞进行表达，可以选择的载体只有pGEMHE，不能用现成的表达载体，增加了实验难度。 进行抗原表位标记的方法很多，常用为聚合酶链式反应，如在PCR 引物序列中加入抗原表 165 位碱基序列以及重叠延伸PCR 等。本实验采用方法为在PCR 引物中加入FLAG 碱基序列， PCR 循环数应尽量少，以减少平台效应和非特异性扩增产物干扰，减少碱基突变发生率。 为便于克隆，还要在引物两端加上酶切位点和保护性碱基。载体与插入片段以相同的限制性 核酸内切酶进行切割，形成同源粘末端，这是最方便的克隆途径。本实验由于载体质粒 pGEMHE 中酶切位点很少，可以选择的酶切位点只有EcoRI，故本次试验只能用单酶切进 170 行连接，无疑中增加了实验难度。 由于本实验上下游引物所加酶切位点相同，用同一种限 制酶剪切形成的载体片段，其两个末端的序列是互补的，在连接反应中能够自身连接，恢复 成环，重新形成原来的载体分子，因此在连接前，必须将线性载体分子进行5’末端脱磷酸 化处理，使载体分子无法自身连接成环，而带有5’端磷酸基团的外源DNA 片段在DNA 连 接酶作用下可有效的与去磷酸化的质粒DNA 连接，形成含两个缺口的开环分子，开环分子 175 的转化效率明显高于去磷酸化的线状DNA。因此脱磷酸化处理后，进行连接反应时，加大 连接酶的用量，方能达到有效连接，减少克隆过程中“空心”克隆产生的数目。由于有高背景 假阳性克隆存在，为阳性克隆筛选增加了很多麻烦，采用菌落PCR 扩增筛选法，既准确又 简单、经济有效[4]。由于此步骤只是筛选故不必用高保真DNA 聚合酶。在连接反应中适当 增加插入片段与载体的摩尔比也是行之有效的一种方法。送样品测序时要多送几个样品，尤 180 其是本实验，插入片段为2000bp，突变机率大，对保真性要求高。重组DNA 成功表达于非 洲爪蟾卵母细胞，双电极电压钳记录电流有表达，PMA 对FLAG 标记的重组通道的抑制程 度与没有带有 FLAG 标记的Kir2.3 通道相同。免疫细胞化学实验证实FLAG 抗原表位标记 短肽确实已与Kir2.3 通道蛋白成功融合并有表达。通过在PCR 引物序列中加入FLAG 序列 所对应的DNA 碱基序列，成功构建了FLAG-Kir2.3-pGEMHE 重组通道， FLAG 标记稳定 185 表达且未影响Kir2.3 通道蛋白功能，为进一步研究Kir2.3 通道的生理功能和调节机制奠定 了基础。 [参考文献] (References) [1] Donglin G, Yajamana R. Mechanism of Rectification in inward rectifier K+ Channels. Journal of General 190 Physiology, 2003, 121: 261-276 [2] Du X, Zhang H, Lopes C. Characteristic Interactions with Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Determine Regulation of Kir Channels by Diverse Modulators. J Biol Chem, 2004, 279(36): 37271 - 37281 [3] Zhao Z, Liu B, Zhang G, et al. Molecular basis for genistein-induced inhibition of Kir2.3 currents. Pflugers Arch-Eur J Physiol. 2008, 456(2): 413-423 195 [4] 沈关心,朱慧芬,张悦.菌落PCR 和质粒PCR 对转化菌的筛选. 免疫学杂志, 2000,2: 149-152 [5] Zhou GY, Qu ZQ, Cui NG, et al. Suppression of Kir2.3 Activity by Protein Kinase C Phosphorylationof the Channel Protein at Threonine 53. J Biol Chem, 1999, 274: 11643-11648 [6] Inanobe A, Fujita A, Ito M. Inward rectifier K+ channel Kir2.3 is localized at the postsynaptic membrane of excitatory synapses. Am J Physiol Cell Physiol, 2002, 282: C1396-C1403 200 学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
