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样条件下常氧组比较 125 2.2 低氧下As2O3、放射线及二者联合对Eca109 细胞周期的影响 低氧-对照组细胞周期出现了明显的G0/G1 期阻滞，G0/G1 期细胞比例明显升高，而 G2/M 期降低，较常氧-对照组均有统计学差异（P<0.05）。与低氧-对照组相比，As2O3 组细 胞G0/G1 期比例降低，G2/M 期又复升高，S 期无明显变化，其细胞周期分布与常氧-对照组 近似。照射组细胞周期分布与低氧-对照组相近。As2O3+照射组细胞G2/M 期阻滞最明显， 130 所占比例达到（37.5±3.5）%（表2）。 表2 低氧下As2O3、放射线及二者联合对Eca109 细胞周期的影响（ x ±s，%） 组别 G0/G1 S G2/M 常氧-对照组 19.3±2.1* 52.6±3.6 28.1±3.3* 低氧-对照组 34.4±2.5 51.7±3.2 13.9±1.8 As2O3 组 23.9±2.2* 49.7±3.8 26.4±1.9* 照射组 33.3±2.6 51.6±4.3 15.1±1.4 As2O3+照射组 23.2±1.8* 39.3±2.7* 37.5±3.5* 注：*P<0.05 与低氧-对照组比较 135 2.3 低氧下As2O3、放射线及二者联合对Eca109 凋亡的影响 低氧-对照组凋亡率与常氧-对照组相近，As2O3 在低氧下可诱导Eca109 细胞凋亡，凋亡 率为（5.79±0.44）%，与放射线联合应用凋亡率增至（12.26±0.61）%，大于二者单独作 用之和（图1）。 2.4 低氧下As2O3、放射线及二者联合对HIF-1α、p27 蛋白表达的影响 140 常氧下，HIF-1α蛋白表达极其微弱，而在低氧-对照组中表达迅速增强（P<0.05）。低 氧下，As2O3 组及As2O3+照射组中HIF-1α表达水平又复降低，而HIF-1α表达水平在照射 组与低氧-对照组中相近，差异无统计学意义（P>0.05）。p27 蛋白在常氧-对照组中即有表 达，低氧处理后表达明显增强（P<0.05）。p27 蛋白在As2O3 组、As2O3+照射组中较低氧- 对照组明显降低（P<0.05），而在照射组中与低氧-对照组无统计学差异（P>0.05）。经相 145 关性分析，HIF-1α与p27 呈正相关（r =0.825, P<0.05）。 常氧-对照组 低氧-对照组 As2O3 组 照射组 As2O3+照射组 注：AP =凋亡率 图1 低氧下As2O3、放射线及二者联合对Eca109 细胞凋亡的影响（ x ±s，%） 150 注：A：常氧-对照组；B：低氧-对照组；C：As2O3 组；D：照射组；E：As2O3+照射组。*P<0.05 与常氧- 对照组比较；#P<0.05 与低氧-对照组比较 图2 As2O3、放射线及二者联合对HIF-1α、p27 蛋白表达的影响 155 3 结论 As2O3 是中药砒霜的主要成分，在急性早幼粒细胞白血病的治疗上取得了非常好的效 果。近年来研究表明，As2O3 对胃癌、肺癌等实体瘤也有明显的抑制作用[10, 11]。低氧是多种 实体性肿瘤包括食管癌在内的共同特征，是恶性肿瘤治疗特别是放射治疗的不利因素。目前 160 有关As2O3 在低氧下对食管癌细胞的作用及放疗增敏方面的研究少见。 本研究首先在常氧和低氧两种条件下观察了不同浓度As2O3 及不同剂量放射线对 Eca109 细胞增殖的影响。MTT 结果显示：在常氧和低氧两种条件下，As2O3 均呈剂量和时 间依赖性地抑制Eca109 细胞增殖，抑制率在常氧和低氧下无统计学差异。而放射线在低氧 下对Eca109 细胞增殖的抑制作用明显减弱。说明低氧可降低放射线对肿瘤细胞的抑制作用， 165 而对As2O3 作用的发挥无影响。 肿瘤放射敏感性与其所处的细胞周期时相密切相关，G2/M 期显著高于S 期和G0 期[12]。 AP=2.00±0.18 AP=2.07±0.17 AP=5.79±0.44 AP=3.16±0.29 AP=12.26±0.61 因此，促使肿瘤G0 与S 期细胞进入并停留在G2/M 期，是提高肿瘤放射敏感性的一个重要 途径。本研究前期实验已经证实常氧下As2O3 通过诱导细胞G2/M 期阻滞来实现其放射增敏 作用，那么在低氧下作用又如何呢？我们采用流式细胞术检测了低氧下As2O3、放射线及二 者联合对食管癌170 Eca109 细胞周期的影响，发现Eca109 细胞在低氧-对照组中G2/M 期细胞 比例较常氧-对照组明显减少，而G0/G1 期明显增加，提示低氧通过影响对G2/M 期阻滞降 低了食管癌Eca109 细胞的放射敏感性，与陈延治等[13]的结论相符。但低氧下经As2O3 作用 后，G2/M 期细胞比例又复增加，G0/G1 期减少，细胞周期分布与常氧-对照组近似，证实低 氧的存在不影响As2O3 发挥对Eca109 细胞G2/M 期阻滞的作用。G2/M 期阻滞在As2O3+照 175 射组中最为明显，G2/M 期细胞比例达到（37.5±3.5）%，提示低氧下As2O3 也能诱导食管 癌Eca109 细胞发生G2/M 期阻滞。 在放射肿瘤学领域，凋亡被认为是一重要的放射敏感性指标，检测照射后凋亡率可间接 反映放射敏感性。凋亡发生率越高，即认为该肿瘤的放射敏感性越高。本研究通过流式细胞 术检测了低氧下As2O3、放射线及二者联合对食管癌Eca109 细胞凋亡的影响，结果显示低 180 氧下，As2O3 可诱导Eca109 细胞凋亡，与放射线联合应用，其凋亡率大于二者单独作用之 和。以上结果提示As2O3 在低氧条件下可通过诱导G2/M 期阻滞提高食管癌Eca109 细胞的 放射敏感性，与Yih 等[14]在宫颈癌研究中得出的结论一致。 低氧可促进HIF-1α高表达，而HIF-1α是低氧诱导细胞周期阻滞的必需元件[15]。细胞 周期素依赖性激酶抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitor, CKIs）p27 可广泛抑制各种细 185 胞周期蛋白（cyclin-dependent kinases, CDKs）和CDKs 的活性，使细胞不能通过G1/S 期转 换关键点，对细胞周期进行负调控[16]。有报道HIF-1α在低氧环境中通过p27 引起G0/G1 阻滞[17]，但p27 本身无低氧反应元件，其调节可能与HIF-1β的活动有关[16]。本研究首次检 测了As2O3、放射线对HIF-1α及p27 蛋白表达的影响，结果显示，低氧条件下，Eca109 细 胞中HIF-1α、p27 表达明显增强，而经As2O3 作用后，HIF-1α、p27 表达又复降低，HIF-1 190 α与p27 呈正相关。而放射线对HIF-1α、p27 的表达无影响。综上所述，低氧条件下，As2O3 有可能通过下调HIF-1α，进而降低p27 表达水平，解除G0/G1 期阻滞，诱导G2/M 期阻滞， 来发挥对食管癌Eca109 细胞的放射增敏作用的。 细胞周期是由三类因子进行精密调节的，它们分别是周期素（cyclins）、CDKs 和CKIs[18]。 除p27 外可能还有其它一些基因参与As2O3 在低氧下的作用过程，具体到不同的肿瘤，作用 195 机制可能也不同，还需要进一步深入研究。目前，如何改善低氧及调控细胞周期以增加放射 敏感性已成为一个研究热点。此外，体外实验毕竟不同于体内，为此，下一步拟通过建立移 植瘤动物模型，检测以上结论在动物体内是否也成立，为临床应用提供进一步的实验依据。 致谢 应向对论文有帮助的有关人士或单位表示谢意。 200 [参考文献] (References) [1] Dewhirst MW, Cao Y, Moeller B. 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