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白藜芦醇对UVA 辐射后成纤维细胞的 影响 陈凰，李远宏，徐学刚，吴严** 作者简介：陈凰，（1984-），女，硕士研究生，美容皮肤病学。 通信联系人：吴严，（1974-），女，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要研究方向:免疫及美容皮肤病 学，皮肤循证医学。E-mail: jlwuyan@126.com 5 （中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001） 摘要：目的：探讨白藜芦醇对长波紫外线（Ultraviolet A, UVA）辐射后人体成纤维细胞增殖 活性及炎性因子的影响。方法：取第四代对数生长期的人体成纤维细胞，用MTT 法检测 0.01mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L 白藜芦醇分别处理后6h、24h、48h、72h 细胞增殖活性，筛选出适宜的浓度。以10J/cm2UVA 辐射细胞后立即加入白藜芦醇，继续培 10 养6h、24h、48h、72h，MTT 法检测细胞的增殖活性，ELISA 法检测上清液中IL-1α、IL-1β、 IL-6 蛋白水平。结果：0.01mmol/L、0.1mmol/L 白藜芦醇对正常人体成纤维细胞增殖活性无 明显影响。0.01mmol/L 白藜芦醇对UVA 辐射后细胞增殖活性有明显的保护作用，对IL-1α、 IL-1β、IL-6 的分泌有明显抑制作用。结论：0.01mmol/L 白藜芦醇对UVA 辐射后的成纤维 细胞有光防护作用，这种作用是通过保护细胞增殖活性及抑制细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6 15 分泌实现的。 关键词：UVA；白藜芦醇；成纤维细胞；细胞因子 中图分类号：R34 The effects of resveratrol on UVA-induced fibroblasts 20 CHEN Huang, LI Yuanhong, XU Xuegang, WU Yan (Department of Dermatology, No.1 hospital of China Medical University, ShenYang 110001) Abstract: Objective: To investigate the effects of resveratrol on ultraviolet A (UVA)-induced cellular proliferation and inflammatory cytokines of human fibroblast. Method: The fourth generation human fibroblasts in logarithmic growth phase were used. Fibroblasts, which were 25 respectively co-cultured with resveratrols in the concentrations of 0.01mmol/L, 0.1mmol/L, 0.5mmol/L, 1.0mmol/L for 6h, 24h, 48h, 72h, were tested using MTT to screen the optimal concentration. Immediately after irradiation with 10J/cm2UVA, the fibroblasts were treated with resveratrols and cultured for 6h, 24h, 48h, 72h. Cellular proliferation was tested using MTT, and the levels of IL-1α, IL-1β, IL-6 were measured using ELISA. Results: 0.01mmol/L and 30 0.1mmol/L resveratrols showed no influence on the cellular proliferation of normal human fibroblasts. 0.01mmol/L resveratrol prsent obviously protective effects on UVA-induced inhibition of cellular proliferation and secretion of IL-1α, IL-1β, IL-6. Conclusion: Resveratrol in 0.01mmol/L has photo-protective effects on UVA-induced fibroblasts, and the procedure is closely related to cellular proliferation and cytokines IL-1α, IL-1β, IL-6 secretion. 35 Keywords: UVA; Resveratrol; fibroblast; cytokine 0 引言 白藜芦醇是一类广泛存在于植物和食物如决明、藜芦、虎杖、松树、葡萄、红酒、桑葚、 花生等中的多酚类化合物。以往研究发现它具有抗炎、免疫调节、抗血小板聚集、抗动脉粥 40 样硬化等作用而应用于心脑血管疾病的治疗[1]。近年来研究发现白藜芦醇还具有促进肿瘤细 胞凋亡、抗氧化、光防护能力等作用[2,3,4]，因而受到了越来越多的研究者的重视。我们以体 外培养的第四代人体成纤维细胞作为长波紫外线（Ultraviolet A, UVA）光源的靶细胞，观察 不同UVA 辐射剂量及辐射后不同时间点细胞增殖活性和上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6 蛋白 水平的变化，探讨白藜芦醇对UVA 辐射人体成纤维细胞的光防护作用机制。 45 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM 培养基、胎牛血清、DS 培养基（DMEM＋10%胎牛血清）、胰蛋白酶（Hyclone， 日本）、培养瓶及培养板（labserv，美国），白藜芦醇（纯度＞98%，雅诗兰黛，美国）， ELISA 试剂盒（R＆D，美国），噻唑蓝MTT、DMSO、SSA-01 型UVA 辐射仪（Sigma， 50 上海）,550 型酶标仪（Bio-Ran Laboratories Inc.，加拿大） , 二氧化碳培养箱 （BB16，德 国）。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养及传代 细胞培养及传代：取健康人包皮环切术后包皮组织，用含双抗（青霉素100000U/L、链 55 霉素100mg/L）的PBS 缓冲液漂洗3 次，尽量剔除皮下脂肪组织，剪成0.5cm×0.5cm 的皮 片，加入0.25%的胰蛋白酶4℃消化过夜。次日分离真表皮，将真皮部分剪碎后加入适量0.25% 的胰蛋白酶37℃消化5min，加入DS 培养基终止消化，200 目尼龙网过滤，过滤后的细胞 1000r/min 离心5min，弃上清，加入适量DS 培养基接种在25cm2 培养瓶中，置于37℃、 5%CO2、饱和湿度条件的培养箱孵育。待细胞贴壁生长融合达80%，用0.25%的胰蛋白酶1： 60 2 消化传代，取第四代对数生长期细胞用于进一步的实验。 1.2.2 白藜芦醇对成纤维细胞增殖活性的影响 取第四代成纤维细胞，胰酶消化后，制备细胞悬液，调整浓度为5×104/ml，每孔200μl 接种于96 孔板，待细胞贴壁融合至80%，弃培养基，各组分别加入终浓度为0.01mmol/L、 0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L 白藜芦醇（母液为200mmol/L，DMSO 配制）的DS 培 65 养基200μl，每组6 个复孔，同时设空白对照组及5‰DMSO 对照组，继续培养6h、24h、 48h、72h 后，加入MTT 液（5mg/ml，PBS 配制）20μl，37℃避光孵育4h 后弃上清，加入 150μl DMSO，震荡10min，直到紫蓝色沉淀完全溶解，于酶标仪450nm 波长处读取OD 值， 调零孔调零。计算细胞增殖率=（加药组OD 值-调零孔OD 值）/（空白对照组OD 值-调零 孔OD 值）×100%。 70 1.2.3 白藜芦醇对UVA 辐射后成纤维细胞增殖活性的影响 将80%融合状态的细胞用DS 培养基调整细胞密度为5×104/ml，定量接种于96 孔板和 6 孔板。实验分为空白对照组、UVA 组、UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇组、UVA+0. 1mmol/L 白藜芦醇组，每组6 个复孔，重复实验3 次。辐射前弃去各孔培养液，PBS 清洗2 遍后加入 少量PBS 覆盖，接受辐射的细胞予10J/cm2 剂量的UVA，照完光后弃覆盖液，按实验分组 75 向各孔中加入DS 培养基或终浓度为0.01mmol/L、0.1mmol/L 白藜芦醇的DS 培养基，置二 氧化碳培养箱中继续培养6h、24h、48h、72h。按1.2.2 方法对96 孔板的细胞进行MTT 实 验。计算细胞增殖率=（实验组OD 值-调零孔OD 值）/（空白对照组OD 值-调零孔OD 值） ×100%。 1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子分泌量 80 按1.2.3 分组收集6h、24h、48h、72h 的6 孔板中细胞上清液，严格按照说明书操作， 于酶标仪450nm 波长处读取OD 值，调零孔调零。 1.2.5 用SPSS17.0 统计软件对实验结果进行统计学分析 采用单因素方差分析进行数据比较。P<0.05 认为差异有统计学意义。 2 结果 85 2.1 白藜芦醇对正常成纤维细胞增殖活性的影响 与空白组各观察点的细胞增殖活性（约100%）相比，0.01mmol/L、0.1mmol/L 白藜芦 醇组无明显差异（P>0.05）；0.5mmol/L、1.0mmol/L 组则显著下降（P<0.05）。其中，0.5mmol/L 组6h、24h 时降至75%以下，48h、72h 显著下降至约30%（P<0.05）；1.0mmol/L 组6h 时 降至70%以下，24h 降至约45%，48h、72h 进一步下降至30%以下（P<0.05）。结果见表1。 90 2.2 白藜芦醇对UVA 辐射成纤维细胞增殖活性的影响 UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇处理的细胞增值率在各时间点均显著高于单独UVA 辐射组 （P<0.05），在6h、24h、48h 时显著低于空白对照组（P<0.05）；而UVA+0.1mmol/L 白藜 芦醇处理在各时间点与UVA 组无显著差异（P>0.05），但显著低于空白对照组（P<0.05）。 在6h 、48h 、72h ， UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇组细胞增殖率显著高于此时间点 95 UVA+0.1mmol/L 白藜芦醇组（P<0.05）。结果见表2。 2.3 白藜芦醇对UVA 辐射成纤维细胞上清液中细胞因子的影响 2.3.1 IL-1α 蛋白 予UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇处理6h、24h、48h 时IL-1α 蛋白水平均显著低于UVA 组（P<0.05），72h 时与UVA 组无差异（P>0.05）；予UVA+0.1mmol/L 白藜芦醇处理后各 100 时间点上IL-1α 均与UVA 组无差异（P>0.05）。UVA +0.01 mmol/L 白藜芦醇组6h IL-1α 蛋 白水平显著低于此时间点UVA +0.1 mmol/L 白藜芦醇组，亦显著低于组内24h、72h 水平 （P<0.05）。结果见表3。 2.3.2 IL-1β 予UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇处理后各时间点IL-1β 蛋白水平均显著低于UVA 组 105 （P<0.05），予UVA+0.1mmol/L 白藜芦醇处理后各时间点上IL-1α 均与UVA 组无差异 （P>0.05）。UVA +0.01 mmol/L 白藜芦醇组6h IL-1β 蛋白水平显著低于此时间点UVA +0.1 mmol/L 白藜芦醇组，亦显著低于组内24h、48h、72h 水平（P<0.05）。结果见表4。 2.3.3 IL-6 蛋白 予UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇处理后各时间点及予UVA+0.1mmol/L 白藜芦醇处理的 110 6h、24h 的IL-6 蛋白水平均显著UVA 组（P<0.05），UVA+0.1mmol/L 组48h、72h 与UVA 组无差别（P>0.05）。UVA +0.01 mmol/L 白藜芦醇组6h 时 IL-6 蛋白水平显著低于此时间 点UVA +0.1 mmol/L 白藜芦醇组（P<0.05）。结果见表5。 115 表1 不同浓度白藜芦醇作用后不同时间点成纤维细胞的增殖率（ x ±s, n=6, %） Tab.1 Cellular proliferation rates at different time point after resveratrol( 120 x ±s,n=6,%) 6h 24h 48h 72h DMSO 组 空白对照组 0.01mmol/L 白藜芦醇组 0.1mmol/L 白藜芦醇组 0.5mmol/L 白藜芦醇组 1.0mmol/L 白藜芦醇组 96.32±18.60 100.00±26.66 105.35±23.29 109.91±11.15(1) 72.54±14.66★(2) 66.93±32.83★(2) 100.61±20.52 100.00±8.73 93.90±9.30 91.94±11.71 74.51±7.72★(2) 46.51±3.52★(2) 96.23±9.23 100.00±18.09 112.69±20.03 89.13±6.17 37.65±6.53★ 29.85±5.19★(3) 104.12±5.36 100.00±13.31 101.04±6.28 92.56±11.48 31.99±8.29★ 21.15±5.76★ 注：★表示显著低于此时间点空白对照组（P<0.05）。 (1)表示显著高于组内24h、48h、72h 增值率（P<0.05），(2)表示显著高于组内48h、72h 增殖率（P<0.05）， (3)表示显著高于组内72h 增殖率（P<0.05）。 125 表2 白藜芦醇对10J/cm2UVA 辐射后成纤维细胞增殖率的影响（ x ±s ,n=6,%） Tab.2 The effect of resveratrol on cellular proliferation rates after 10J/cm2UVA irradiation( x ±s,n=6,%) 6h 24h 48h 72h 空白对照组 UVA 组 UVA+0.01mmol/L 白藜芦醇组 UVA+0.1mmol/L 白藜芦醇组 100.04±10.78 78.01±12.74★ 88.20±8.40★＃● 77.62±18.11★ 学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
