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大鼠的第三脑室注射26RFa两小时内，能增加在光照条件（白天阶段）下的摄食量，但无统计意义，并且不改变总摄食量[30]。而且，随意进食的雄性大鼠侧脑室注射43RFa，对其1小时内和24小时内的累积摄食量也无影响[35]。但大鼠侧脑室注射26RFa和43RFa，在150 1小时、2小时和4小时内能剂量依赖地增加了其对55%脂类的高脂食物的累积摄取量[36]。同样的，在生育期雌性大鼠的侧脑室中注射26RFa，也能增加雌性大鼠对高脂食物的摄取，但对低脂食物的摄取无影响[27]。当正常大鼠或生育期的雌性大鼠长期摄入高脂食物后，大鼠26RFa前体mRNA下丘脑腹内侧区/弓状核表达水平增加而受体GPR103的mRNA表达水平无改变[27, 36]。进一步的研究探讨了26RFa的摄食调节的作用机制，并评价了26RFa与155 瘦素之间的相互作用。在连续八周分别摄取高脂、正常和低脂三类不同食物的大鼠体内，通过评价43RFa和瘦素的浓度水平发现，高脂食物组大鼠体内的43RFa含量最低，并且43RFa 的浓度与瘦素的水平成反比，从而推出43RFa在下调瘦素的过程中起着重要的作用[37]。此外，还发现26RFa的受体GPR103存在于弓状核和NPY神经元而不存于阿黑皮素神经元，当侧脑室注射26RFa时能促进NPY在下丘脑底部的表达和释放，但抑制了阿黑皮素的表达160 和α-MSH的释放，这些作用共同促进了其摄食行为[38]。而中枢注射NPY Y1受体拮抗剂Bis(31/31’)NPY31–36和NPY Y5受体拮抗剂CGP71683A能逆转了26RFa对阿黑皮素表达和α-MSH释放的抑制作用，并能拮抗了26RFa所引起的摄食量增加[38]。瘦素对NPY表达和释放的、对阿黑皮素表达和α-MSH的释放以及对食物摄取具有重要作用，而26RFa能够拮抗瘦素的作用[38]。因此，26RFa可能是通过刺激NPY在弓状核中的释放以及进一步抑制阿黑165 皮素表达，从而表现出促进摄食的生物活性。 在鱼类和鸟类中，26RFa的摄食调节作用也开展了部分研究。禁食4天金鱼的下丘脑中 26RFa/QFRP表达水平（即26RFa/QFRP前体mRNA水平）升高了120%，而NPY mRNA表达水平增加了70%[19]。侧脑室注射26RFa能增加肉鸡的摄食量，但对蛋鸡的摄食行为无影响[20]。在雄性斑胸草雀的侧脑室中注射26RFa，能增加24小时内总摄食量，但对动物体170 重无影响[21]。 此外，离体实验结果也证实了26RFa对于机体能量平衡的重要调节作用。大鼠胰腺中灌注一定剂量的26RFa不影响胰岛素的基础分泌，但能抑制葡萄糖所诱导的胰岛素分泌，而对精氨酸所诱导的胰高血糖素的分泌不产生影响[39]。而且，GPR103受体对脂肪生成和脂质代谢也有重要作用[40]。3T3-L1细胞中存在GPR103受体的mRNA和受体蛋白，以及少量175 43RFa 的mRNA。而在3T3-L1分化型细胞中，43RFa和26RFa能诱导甘油三酯的增加，剂量依赖地增加脂肪酸摄取，并且抑制了异丙肾上腺素诱导的脂解作用，而且使FATP1, CD36, LPL, ACSL1, PPAR-γ和C/EBP-α等涉及到脂质摄取的基因表达量增加[40]。但当GPR103b受体被抑制时，43RFa和26RFa对异丙肾上腺素诱导的脂解作用和脂肪酸摄取作用也相应地被抑制[40]。而且在肥胖个体中，43RFa和26RFa能够诱导GPR103受体的活化，并能抑180 制异丙肾上腺素所介导的脂解作用[40]。因此，26RFa/ GPR103系统可通过自分泌或旁分泌的方式在外周组织中调节脂质的代谢。 3.2 26RFa对骨生成的调节 美国的Baribault等人通过GPR103-/-基因敲除小鼠模型研究了GPR103受体对于骨生成185 的影响[40]。组织解剖研究发现，GPR103-/-基因敲除小鼠相比野生型体重无明显差异，但软骨生长面更薄，小梁分支增厚，造骨细胞数量减少[40]。同时，GPR103-/-基因敲除雌性小鼠相对于野生型小鼠脊柱弯曲度产生了高于20%的增加，即产生了驼背，而雄性小鼠不易发生，而且GPR103-/-基因缺陷小鼠导致了骨小梁体积的减少，在雌性中减少了30%，雄性中减少了20%[40]。并且发现GPR103受体存在于造骨细胞中，造骨细胞生长的抑制剂和造骨190 细胞分化的诱导剂地塞米松，能抑制了人原代造骨细胞中GPR103受体的表达，从而推测GPR103可能直接激活造骨细胞中受体来促进骨生成[40]。进一步的研究发现，与对照系小鼠相比，具有骨质疏松症倾向的SAMP6系小鼠基因组DNA鉴定出了四种特有的单核苷酸多态性（SNPs）[28]。特别是其中一种单核苷酸多态性存在于一种26RFa基因启动子中，该启动子能产生新的神经元限制性的沉默因子结合位点，而后者能够减少非神经元组织中的基因195 表达[28]。而且，与对照系相比，SAMP6 系小鼠26RFa/43RFa的表达在脊柱和下丘脑都减少[28]。综上所述，26RFa/GPR103可能在维持生物的骨质密度中扮演着重要作用。 3.3 26RFa对性激素分泌的调节 通过在体和离体实验发现26RFa在大鼠体内具有调节促性腺激素分泌的作用[35, 41]。侧200 脑室注射26RFa和43RFa能引起了血浆中黄体激素和促卵泡激素的增加[35, 41]，而且其C末 端片段26RFa(20-26)具有类似的作用[41]。GnRH受体拮抗剂西曲瑞克能够阻断侧脑室注射43RFa引起的血浆黄体激素水平的增加[35]。动情周期和卵巢切除的雌性大鼠中全身注射26RFa也具有与侧脑室注射相似的作用[41]，但雄性大鼠全身注射26RFa没有改变促性腺激素的分泌[41]，且大鼠腹腔注射43RFa也不影响促性腺激素的分泌[35]。在雄性和动情周期雌205 性大鼠垂体组织中，26RFa和43RFa剂量依赖地升高了基础的和促性腺激素释放素刺激的黄体分泌[41]。而且43RFa在离体实验中刺激了促性腺激素释放素在雄性大鼠下丘脑和GT1-7细胞中的释放[35]。 此外，金鱼腹腔注射适量的26RFa后1小时，血浆黄体激素水平出现升高，而血浆黄体激素水平在较低剂量时，或者金鱼原代培养细胞中无改变[19]。因此，26RFa在非哺乳类动210 物中对促性腺轴的也具有一定的调节作用。 3.4 26RFa对心血管活性的影响 26RFa/43RFa在哺乳动物中具有调节其心血管活性的功能[18, 42, 43]。清醒小鼠中，侧脑室注射43RFa能够显著地升高平均动脉压和心率，注射20-30分钟后达到最大值，而且其作用215 能持续两个小时以上[18]。我们研究小组研究发现，大鼠静脉注射26RFa引起了血压的两相变化以及心率的升高[42]。血压升高作用能被α和β肾上腺素受体拮抗剂酚妥拉明和普萘洛尔拮抗，而心动过速反应能被颈动脉两侧迷走神经切除术以及β肾上腺素受体拮抗剂阻断[42]。26RFa的片段26RFa(8-26)和26RFa(19-26)也具有的增加心率的作用，但只引起了血压的升高[42]。而且，人RFRP-1和大鼠RFRP-1 能以剂量依赖地、快速并可逆地减弱哺乳动物220 心肌细胞的收缩，而结构上与RFRP-1相关的26RFa片段26RFa(8-26)和26RFa(19-26)，在相应剂量下对心肌细胞的收缩功能无影响[43]。 3.5 26RFa对痛觉的调节 26RFa在痛觉调节中的作用也被初步地证实，在不同的致痛模型以及不同的给药方式中225 26RFa作用不完全一致[26, 44, 45]。在福尔马林诱导的大鼠炎症痛模型中，鞘内注射26RFa能剂量依赖地减弱福尔马林诱导的炎症痛，这种作用不能被鞘内注射BIBP3226所拮抗[26]。侧脑室注射26RFa也能剂量依赖地减弱福尔马林的致痛作用，但BIBP3226能拮抗26RFa在第一相的作用[44]。值得注意的是，腹腔注射26RFa对福尔马林诱导的在两相的疼痛都没有作用[44]。在局部坐骨神经结扎诱导的神经痛大鼠中，鞘内注射和侧脑室注射26RFa都能产生230 长时间的持续镇痛作用，且不能被BIBP3226拮抗[45]。同样，鞘内注射26RFa也能减弱叉菜胶诱导的炎症痛[26]，但鞘内注射或侧脑室注射26RFa对52.5℃的热板痛以及机械痛等急性痛无影响[26, 44, 45]。 3.6 26RFa的其它调节作用 235 除了上述生理活性外，26RFa/43RFa被发现还有其它的一些功能，如人43RFa大鼠静脉注射引起了血浆中醛固酮水平的增加[16]，43RFa侧脑室给药能够引起小鼠理毛时间和理毛次数的增加[18]，26RFa和43RFa能剂量依赖性的增加小鼠的运动活性[23]，以及侧脑室慢性注射43RFa两周后小鼠体温与对照组相比有所降低[34]等等。 240 4. 26RFa的构效关系研究 Thuau等人通过CD谱和核磁谱研究了26RFa在水、三氟乙醇和甲醇几种不同溶剂中的溶液结构[46]。在水中，虽然26RFa在残基6-15之间存在初级的螺旋结构，但主要还是以无规卷曲结构存在[46]。而在甲醇或三氟乙醇中，26RFa具有螺旋结构，其在残基4-17之间采取了一种两亲性的α螺旋结构而不是310螺旋，而两侧是N末端和C末端的不稳定区域[46]。 245 最早的构效关系研究中初步探讨了43RFa的C末端和N末端结构对其功能的影响。利用放射性配体[125I-Tyr32] 43RFa检测发现，26RFa和43RFa能特异性结合GPR103受体，其 IC50值分别为3.2和0.52nM，而26RF(OH)对GPR103的特异性结合能力丧失，当26RFa序列从N端逐渐递减时其特异性结合能力也逐渐降低，且43RFa的C末端八肽结构是特异性结合GPR103受体所必需的[16]。 250 最近，Marec等人系统研究了26RFa的构效关系。在Gα16-hGPR103转染的CHO细胞中通过钙流检测法评价了一系列26RFa类似物的生物活性[22]。人26RFa的N末端缺失三个、六个、九个氨基酸（即26RFa(4-26)、26RFa(6-26)和26RFa(9-26)）没有显著地影响钙动员能力，继续缺失三个、四个、五个氨基酸（即26RFa(13-26)、26RFa(14-26)和26RFa(15-26)）则效价比人26RFa降低了10-20倍，更短的片段（即26RFa(16-26)、26RFa(17-26)和255 26RFa(18-26)）其效价降低了大约30倍，26RFa(19-26)和26RFa(20-26)效价降低了约75倍，而26RFa(21-26) 和26RFa(22-26)则不具有活性[22]。人26RFa(8-16)和人26RFa(4-17) 等中间片段以及26RFa(1-16)和26RFa(1-18)等N末端片段既不具有激动活性也没有拮抗活性[22]。虽然C端七肽26RFa(20-26)与人26RFa相比效价低了70多倍，但具有同样的效能，这一结果与43RFa的构效关系研究结果一致，值得注意的是们的C末端八肽结构是26RFa/43RFa260 是进化保守序列。因此，26RFa(20-26)是GPR103受体的最小活性片段，是设计相应的小分子配体的化学模板。 对26RFa(20-26)各位点进行丙氨酸替换扫描， 20、20、22、23四个位点的替换基本不影响肽对受体的激活，但替换最后三位则完全丧失了的激动活性[22]。D型氨基酸替换发现，23位的Ser无明显变化，为非关键位点[22]。对23位的Ser进行一系列天然和非天然氨基酸265 替换，发现丝氨酸侧链基团的羟甲基进行丁基和叔丁基修饰没有影响母体七肽片段的活性，而Leu、Tle、Val和Cha则使效价降低了2-2.5倍[22]。值得注意的是，Nva替换则使效价提高了3倍[22]。进一步研究发现，去末端酰胺的人26RFa效价降低了至少50倍，而去末端酰胺的26RFa(20-26)则完全丧失了对受体的激活能力[22]。末端酰胺双苯甲基取代的类似物也大 大地降低其激动活性，而单苯甲基取代的26RFa几乎具有和母体一样的效价，但单苯甲基270 取代的26RFa(20-26)则完全丧失了活性[22]。 因此，26RFa/QRFP的N端序列对于维持高亲和力是必需的，但N端不参与受体的活化，而C端尤其是C末端RFa结构对于GPR103受体的特异性结合，以及其生物活性的维持起着至关重要的作用。同时，由于26RFa(20-26)是具有活性的最短片段且23位的Ser为非关键位点[22]。根据以上的研究结果，推测啮齿类26RFa的二级结构如下图所示： 275 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
