地被菊β微管蛋白基因的克隆及表达分析#
 

摘要：通过RT-PCR、RACE 技术从地被菊‘雨花金华’中成功克隆了一个β微管蛋白基因，命名为CmTUB，基因登录号为AB608732。序列分析发现，CmTUB 基因cDNA 全长为1544bp，编码446 个氨基酸，氨基酸序列由一个包含198 个氨基酸残基的GTPase 结构域和138 个氨基酸残基的C-端组成，并包含6 个与微管蛋白连接相关的功能域。系统进化树分析表明与棉花等双子叶植物亲缘关系较近。荧光定量PCR 分析结果表明，CmTUB 基因属于组成型表达基因，重力可以抑制CmTUB 在背地侧的表达；NAA 和CaCl2可以促进涂抹侧的表达；TIBA 和EGTA 则对涂抹侧CmTUB 的表达具有抑制作用。
 

关键词：地被菊；β微管蛋白；序列分析；实时荧光定量

0 引言
地被菊‘雨花金华’(Chrysanthemum morifolium ‘Yuhuajinhua’)是南京农业大学园艺学院花卉遗传育种研究所于近年选育出的一批株型完全匍匐、茎节部着生气生根、生长旺盛的新品种[1]之一，与传统的地被菊品种相比，匍匐生长的株型是‘雨花金华’最具园林应用价值的一个优良性状。完全匍匐型地被菊‘雨花金华’形态与生理机制的研究揭示匍匐茎正常响应于重力刺激，为横向重力性反应[2]。微管是真核生物细胞骨架的主要成分之一，在植物的生长、发育等生命过程中起到非常重要的作用[3]。微管由α 和β 微管蛋白二聚体共同组成，由多基因编码组成，这些基因在物种之间各不相同[4]。在植物中，微管蛋白几乎参与了植物生长发育的所有过程。在拟南芥中，基因组至少编码6 种α 微管蛋白、9 种β 微管蛋白以及2 种γ 微管蛋白[5-7]。微管蛋白基因并不是同时在植物体内表达，而是由于基因突变在植物体内分组织、分阶段进行表达[4]。为了探讨地被菊匍匐茎形成的分子机理，本研究以匍匐型地被菊‘雨花金华’为试材，以抑制差减杂交文库中分离出的基因片段为基础，在比对分析确定微管蛋白基因与匍匐茎的向重性弯曲生长关系最为密切后，对CmTUB 基因进行了同源克隆和表达分析。

3 讨论
菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有观赏、食用及药用等多种价值。菊花类型和花色丰富，是切花、盆栽和园林地被应用的重要花卉种类，在花卉生产中占有十分重要的地位。株型是观赏植物重要性状之一[10]，选育理想株型是观赏植物育种的一个重要目标。尽管地被菊品种群的提出已有20 年左右的历史，相继选育出了许多优良品种，但与其它品种群相比，不仅品种数量少，而且多数品种属低矮型[1,11]，株型呈完全匍匐生长的新品种奇缺。
 

重力与植物的生长发育，尤其与植物的形态建成有密切关系。植物地上部感受重力后，重力信号经过一系列的传递而在特定组织或器官中产生生长效应，其中生长素等激素与重力刺激下的差异性生长有关。植物的正向重力性和负向重力性的生理机制在拟南芥、水稻、玉米、燕麦等模式植物中取得了长足的进展，部分相关基因已得到分离，而横向重力性的生理机制研究刚刚起步，分子机理研究未见报道。
 

植物的细胞骨架由微丝、微管和微管结合蛋白等共同组成，起维持细胞的组织稳定性、锚泊蛋白、组装纺锤丝、维持细胞内部秩序及胞质流动、构筑细胞壁等作用[12]。微管在细胞形态建成、细胞运动、细胞分裂以及细胞信号转导中都起着至关重要的作用[13]。对CmTUB编码的氨基酸序列进行分析发现，存在于氨基酸链二级结构中的6 个小型结构域决定着微管蛋白单体在组装成细胞骨架过程中的横向连接及纵向连接[14]，这可能在一定程度上决定着微管在细胞壁中排列方向。在桉树上进行的转基因研究发现，桉树细胞次生壁纤维素微纤维的重排与β 微管蛋白基因EgrTUB1 的表达相关，这说明细胞壁的生成和组织与特定β 微管蛋白单体具有密切联系[15]。另外，有研究显示在金鱼草花茎弯曲部位背地侧的皮层、内皮层及髓可以观察到密集的微管（垂直于生长轴）发生横向排列[16]。“multi-tubulin”假说认为不同的微管蛋白异型体组成了细胞内不同的微管结构[17]。越来越多的研究数据表明，不同的α-微管蛋白和β-微管蛋白异型体组成的微管其结构和功能也有所不同[18]。在植物中，Schroder 等人发现两种大麦α-微管蛋白异型体仅在叶细胞发育过程的特定阶段表达，其表达与叶肉细胞发育中微管骨架排列的变化高度一致[19]；Whittaker 等人发现α-微管蛋白异型体基因转录水平的变化与棉花发育过程中微管阵列及细胞壁结构的变化相吻合[20]。
 

我们在之前的研究中发现，适宜浓度的NAA涂抹在匍匐茎的负向重力侧促进了匍匐茎的横向重性弯曲，而涂抹在正向重力侧则到了抑制效果。在匍匐茎向重性反应部位的两侧分别涂抹IAA 极性运输抑制剂TIBA 后发现，在负向重力侧涂抹TIBA 抑制了匍匐茎的横向重性弯曲，而在正向重力侧涂抹TIBA 则起到了促进作用，与NAA 的作用恰好相反。10 mmol/L CaCl2 溶液显著促进了‘雨花金华’匍匐茎的横向重性弯曲，而5 mmol/L EGTA 溶液则抑制‘雨花金华’匍匐茎的横向重性弯曲[21]。由于Northern 杂交等传统方法灵敏度较低，不能客观真实地反映基因表达的微弱变化，因此本试验采用了灵敏度很高的荧光定量PCR 方法对CmTUB 基因在NAA、TIBA、CaCl2 以及EGTA 处理下的表达变化情况进行了研究。从对照2 中我们可以看出，重力处理后，CmTUB 在向地侧中的表达量没有多大变化，但是在背地侧中的表达却受到抑制。涂抹NAA 后发现，NAA 可以促进涂抹侧CmTUB 的表达量，但是当在背地侧涂抹NAA并进行重力处理后，可以发现基因的表达在一定程度上受到了重力的抑制；在向地侧涂抹NAA 并进行重力处理，重力则在一定程度上了促进了向地侧基因的表达。涂抹生长素运输抑制剂TIBA 对CmTUB 的表达则起到了抑制作用，结果基本与NAA 相反。Muday 早期的研究发现，外源生长素可以促进TUB 的表达，生长素运输抑制剂TIBA 等可以抑制植物的伸长生长以及向重性反应等生理过程[22]。外源Ca2+可以在一定程度上促进TUB 基因的表达，而钙离子螯合剂EGTA则在一定程度上抑制了基因的表达。有研究报道，钙离子螯合剂比如EGTA 等可以通过螯合细胞壁内的钙离子使细胞的韧性降低，从而影响植物对外界刺激的反应[23]。
 

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