高速逆流色谱的发展应用
李莉，魏贤勇，史大玲，李鹏，王玉高，赵亮**
作者简介：李莉，（1985-），女，硕士研究生，煤化工
通信联系人：魏贤勇，（1958-），男，教授，主要研究方向：煤中有机质的组成结构和高附加值利用. E-mail:
lili10-12@163.com
（中国矿业大学化工学院，江苏 徐州 221116）
5 摘要：高速逆流色谱是近二十年发展和完善起来的液-液逆流色谱，由于其不使用固定相作
为载体，因此在分离天然产物、蛋白质和抗生素物质尤其是在传统中药有效成分的制备和分
离上得到了广泛的应用。本文还介绍了高速逆流色谱的工作原理，简述了高速逆流色谱与仪
器联用方面的新进展。
关键词：高速；逆流色谱；溶剂体系；分离；联用技术
10 中图分类号：O657.7+2
Development in High-speed Countercurrent
Chromatography
LI Li, WEI Xianyong, SHI Daling, LI Peng, WANG Yugao, ZHAO Liang
15 (School of Chemical Engineering and Technology, China University of Mining and Technology,
JiangSu XuZhou 221116)
Abstract: IHigh-speed countercurrent chromatography(HSCCC) without solid support, is a
liquid-liquid separation chromatographic technique, which has been developed in recent twenty
years. This paper summarized the application and purification of HSCCC on the natural product,
20 protein, antibiotics, inorganic compounds and so on in fields of preparative isolation, especially
the application on the fields of purification and isolation Chinese herbal medicine and the effective
ingredients of the plant medicine. This paper also tallied up the appropriate solvent system of
HSCCC, and prospected HSCCC connected with other detector.
Keywords: high-speed; countercurrent chromatograph; solventsystem; separation; hyphenated
25 technique
0 引言
高速逆流色谱（High-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC）是由美国国家
医学研究院由美国国家医学研究院(National Institute of Health, USA)的伊东洋一郎(Ito
30 Yoichiro)博士于20 世纪80 年代研制的一种新型色谱技术。它是一种基于多级逆流液液萃取
的分析及制备色谱,溶质依靠在离心力场下旋转的空心螺旋管中逆向流动的两个不相混溶液
体间，溶质分配系数的不同而实现的分离。
1 HSCCC 的工作原理和特点
HSCCC 基于多级逆流液-萃取的分析及制备色谱，它利用溶质在两种互不相溶的溶剂中
35 分配系数的不同而实现的分离。它利用液体螺线管高速行星式运动动力学原理，在螺线管中
注入互不相溶的上下相平衡溶液，使两相在聚四氟乙烯螺线管中作高速行星式运动，如果达
到临界转速，其中的一相会完全占据螺线管的一端，称之为首端，而另一相则会完全占据另
一端，称之为尾端。如果螺线管处于临界转速，此时将首端相溶液由尾端注入，这样首端相
溶液会不断的穿过尾端相溶液而从首端流出，反之亦然。固定相在离心场作用下相对停留在
40 螺旋管中，流动相通过恒流泵连续输入的螺旋管内部，在螺旋管自转所产生的阿基米德螺旋
线力作用下，由螺旋管的尾端向首端流动，具有不同分配比的样品在流动相和固定相的相对
 移动过程中进行多次连续分配，在流动相中分配比大的首先被洗脱，在固定相中分配比大的
后被洗脱，最终得到完全分离。
逆流色谱是萃取和色谱技术的结合，因此有很多优点：HSCCC 通常不需要填充色谱中
45 的固体固定相，因此它克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点；由
于其分离级数很大，因此分离出来的谱峰一般都只包括一种纯物质；粗样可以直接上样而不
会对柱子内的固定相造成损害；滞留在柱子中的样品可以通过多种洗脱方式完全回收；溶剂
都是易挥发的低分子溶剂，价格便宜。HSCCC 重现性好，如果样品不具有较强的表面活性
作用，酸碱性也不强，即使是多次进样，其分离过程都能保持稳定，重现性也很好。当分析
50 型的HSCCC 仪器转速达到2000 r/ min 以上时，在溶剂体系合适的情况下，其分离速度可以
与HPLC 相媲美；逆流色谱能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样具有制备能力。
现在试验用的逆流色谱仪，制得的纯品量约为几毫克到几十毫克之间。国内厂家研制的较大
型逆流色谱仪，其产出能力可增加十倍。张天佑教授的研究小组最先研制出了分析型和制备
型的高速逆流色谱仪，在对天然产物的分离制备方面，其研究水平处于国际领先地位。英国
55 致力于逆流色谱的化工放大，转股体积可达25 L，流速可达1 L/ min，如此规模可以算得上
工业化的生产规模[1]。
由于两相溶剂在高速旋转的螺旋管内，可以进行充分、快速、高效的混和和分配，且固
定相的比例较高，使得HSCCC 的制备量比HPLC 大得多。同时由于其不需要昂贵的色谱柱
填料，因而费用较低。
60 HSCCC 洗脱方式多样，流动相可以是上相或下相、有机相或水相。甚至可以使两相溶
剂同时双向流动，实现真正连续的逆流色谱过程。还可以实现多种形式的梯度洗脱过程，如
pH 梯度、极性梯度等。
2 溶剂体系的选择
逆流色谱的分离原理是根据样品在两相中的分配系数的不同而实现的分离。HSCCC 需
65 要一个适宜的液-液萃取分离体系，所谓的适宜体系，就是有低沸点的溶剂，有适宜的溶解
度和分配系数差的溶质，因而可以通过改变溶剂体系的极性，来实现对不同极性物质的分离。
还可以在液态固定相和流动相中添加合适的离子对试剂或手性试剂，来实现某些酸碱物质和
异构体的手性分离的制备。
在选择逆流色谱的溶剂体系时，应该遵循以下几个原则：两相能够形成稳定的溶剂体系；
70 样品在足够高的溶解度及合适的分配系数；固定相能实现足够高的保留；两相体系不造成样
品的分解和变性[2]。
一般HSCCC 溶剂系统包括疏水性、亲水性和双水相溶剂体系。疏水性体系包括己烷/
水、乙酸乙酯/水和三氯甲烷/水等系统。亲水性溶液体系包括正丁醇/乙酸/水和异丁醇/水系
统。在这两类体系中，一般多用甲醇、乙腈、乙醚、四氯化碳等溶剂调节上相或下相的极性，
75 以达到目标组分的良好分离。双水相体系不多见，主要是聚乙二醇与磷酸钾缓冲液组成的双
水相系统。
对未知混合物，可以从正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1:1:1:1 和氯仿:甲醇:水= 10:3:7 两个两
相溶剂体系开始，再根据目标组分的分配系数调节溶剂组成[3]。将未知混合物溶解于含有相
同体积上下相溶液的试管中，采用薄层层析法或高效液相色谱法来测定各组分上下相的分配
80 系数，使分配系数大约在1 左右。
由于目前溶液体系的选择和优化一般是根据实验经验,缺乏充分的理论依据。因此要加
 强理论研究，借助于物理化学中的相平衡理论和化学热力学相关理论来解决逆流色谱中的溶
剂体系的选择问题。
在逆流色谱分离中，影响分离效果的除了溶剂体系还有溶剂体系固定相的保留率，而此
85 保留率与逆流色谱的仪器参数和运行条件直接相关。目前的逆流色谱仪器，对分离蛋白质等
生物大分子所需要的双水相体系和分离极性化合物所需要的极性溶剂体系保留能力较差，因
此近几年对逆流色谱的研究热点是提高其对固定相的保留能力。螺旋槽圆盘柱和螺旋管圆盘
柱等的研制，表明它们对不同溶剂体系的固定相保留能力有所提高，尤其是对极性溶剂体系
和双水相体系，因而有望成为新一代的商业化逆流色谱仪[4]。
90 3 HSCCC 的应用进展
HSCCC 由于其适用范围广、制备量大、操作简单和高速快效等优点[5-9]，被广泛应用于
天然产物化学、生物工程、环境、食品、农业、医药和材料等领域[10-14]。
3.1 天然产物
HSCCC 可以采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，有很强的适应性，不
95 但适用于极性化合物，同时也适用于非极性化合物；既可以用于天然产物粗提物的去杂，也
可以用于最后产物的精制，甚至可以得到纯品。适宜从天然产物中提取不同极性的有效成分。
因此，HSCCC 被大量用于天然产物化学成分的分析和分离。
Fu 等[15]用氯仿:甲醇：0.3 mol/L :0.2 mol/L 盐酸(4:1:5:2)体系和异丁基甲醚:四氢呋喃:水
( 2:2:3)体系从高乌头中分离拉巴乌头碱，冉乌头碱等。黄丹凤等[16]用正丁醇-乙酸乙酯-水
100 (1:3:4)作溶剂体系，采用高速逆流色谱与硅胶柱色谱结合的方法，从老芦荟干粉中分离制备
高纯度芦荟素异构体。王凤美等[17]以正己烷-乙酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5)为溶剂系统，用
高速逆流色谱分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质，实验发现：一次分离可制备63.4 mg
丹酚酸B，其纯度98.6%。
张云峰等[18]在固定相为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(体积比5:3:6:6)的上相，流动相为正己
105 烷-乙酸乙酯-乙醇-水(体积比5:3:6:6)到正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(体积比5:3:5:7)的两相溶剂
系统中，对决明子的乙酸乙酯萃取物进行分离纯化得到5 种高纯度的蒽醌类单体化合物，纯
度均大于93%。
3.2 抗生素
用HSCCC 分析抗生素时，进样量一般为1 mg~5 g，分离度和样品回收率高的优势，使
110 得HSCCC 在抗生素单组份标准品的制备和多组分同系物的分离纯化得到更为广泛的应用。
在HSCCC 中，一般用疏水性体系分离抗生素。对于强极性组分用含有正丁醇的体系，中等
疏水体系用含有氯仿的体系，疏水性用含有正己烷的体系。
3.3 蛋白质和肽
用HSCCC 分离制备蛋白或多肽的混合物是最近几年才发展起来的，一般用亲水性溶液
115 体系的溶剂系统，也有采用疏水性溶液体系的报道。HSCCC 设备具有较高的分辨率和稳定
性，因而为生物大分子的高效分离提供了有利的途径。
最近的进展主要取决于以下3 种因素：采用低粘度的溶剂体系，溶剂体系大部分包含正
丁醇；新型的pH 区带提取逆流色谱的出现和发展；HSCCC 与离子对逆流色谱的综合应用。
 3.4 食品
120 HSCCC 应用于食品分离的最大优势是粗品或复杂样品可直接进样，一般用于食品除毒
去杂或制备生物活性物质[19]。
Oka 等[20]以叔丁基甲基醚-正丁醇-乙腈-水（2:2:1:5）为溶剂系统分离虫胶中的四种乳酸，
经过HPLC 鉴定，其纯度分别达到97.2%、98.1%、98.2%和95.0%。北京天然产物分离纯化
研究中心同英国联合利华公司合作，利用逆流色谱仪制备的儿茶素、茶色素等开发新一代饮
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