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【摘要】 随着化石能源的日益短缺和环保要求的逐渐提高,氢能作为清洁、高效的可再生能源载体越来越受到人们的重视。利用生物质原料通过细菌发酵方法制取氢气新能源具有很强的应用前景,而通过基因工程和代谢调控手段改造产氢细菌是生物制氢领域的研究热点。本文在国际上首次测得阴沟肠杆菌在过表达产氢增强基因后的氢酶活性提高了97.4%,利用混合菌群驯化和微波稀酸水解联合活性炭脱毒使水葫芦发酵产氢量提高了111.1%；500升半连续中试得到水葫芦发酵联产氢气和甲烷的能源转化效率达到51.3%。本文首先以高效产氢细菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae CICC10017和产气肠杆菌Enterobacter aerogenes ATCC13408为主要研究对象,对其过表达外源产氢增强基因后的氢酶活性、利用葡萄糖的产氢能力和代谢途径进行了研究。阴沟肠杆菌E. cloacae CICC10017在过表达了一种产氢增强基因后,氢酶活性由原来的270.93ml-H2/(g-DW·h)提高到了534.78ml-H2/(g-DW-h),单位底物产氢量也由1.29mol-H2/mol-葡萄糖提高到了2.54mol-H2/mol-葡萄糖,产氢量提高了97.9%。改造菌的发酵液中乙酸和丁酸的产量增加,乙醇产量减少,这与产氢量高时的NADH代谢机理是一致的。产气肠杆菌Enterobacter aerogenes ATCC13408在过表达氢酶hyc操纵子大、小亚基的基因后,氢酶活性分别提高了124%和67%,氢气产量也由1.16mol-H2/mol-葡萄糖分别提高至2.16mol-H2/mol-葡萄糖和1.97mol-H2/mol-葡萄糖；在过表达了蓝藻Synechocystis sp. PCC6803氢酶hoxUYH基因后,氢酶活性提高了153.8%,氢气产量由1.27mol-H2/mol-葡萄糖提高到2.39mol-H2/mol-葡萄糖。在此基础上又进行了基因改造细菌利用预处理水葫芦产氢的实验研究,过表达产氢增强基因后的阴沟肠杆菌利用水葫芦产氢能力最高,产量为74.9ml-H2/g-TVS。本文针对木质纤维素、蛋白质和油脂等三大类复杂有机物的发酵联产氢气和甲烷特性开展了研究。利用生物质原料对混合菌群进行驯化培养加强优势菌种的适应性,对大分子有机物强化水解得到易于发酵的小分子原料。16S rDNA分析结果表明,混合菌种经过木糖驯化培养富集,种群多样性更高,多种梭菌属并存为优势菌种,种群多样性提高使木糖的产氢量提高了45%。木糖联产氢气和甲烷量为190.6ml-H2/g-木糖和216.5ml-CH4/g-木糖,联产的能源转化率达67.48%。乳蛋白联产氢气和甲烷量为136.5ml-H2/g-TVS和157.8ml-CH4/g-TVS,联产的能源转化效率为41.9%。水葫芦经过稀酸/微波/酶预处理工艺,其水解糖化率可以达到91.36%,从而使水葫芦发酵产氢量比常规的酶水解显著提高了62.8%,而采用混合菌群驯化后使水葫芦发酵产氢量提高了95.5%,进一步使用活性炭脱毒后使水葫芦发酵产氢量提高了111.1%。水葫芦暗发酵得到氢气产量为134.9ml-H2/g-TVS,利用其产氢废液继续联产甲烷量为107.7ml-CH4/g-TVS。利用50升和500升的两个串联发酵罐实现了水葫芦发酵联产H2和CH4的半连续流中试,得到连续稳定的氢气和甲烷产生速率分别为340.9±36.6ml-H2(L·d)和184.3±10.4ml-CH4/(L·d)。利用混合菌群驯化和微波稀酸水解使水葫芦中试联产氢气和甲烷的能源转化效率提高到51.3%。
【关键词】 氢气； 甲烷； 发酵； 细菌； 基因改造； 驯化； 生物质； 水葫芦；
致谢 5-7
前言 7-8
摘要 8-10
Abstract 10-11
目录 13-18
1 绪论 18-36
1.1 氢能的研究意义 18-22
1.2 微生物制氢的国内外研究现状 22-32
1.2.1 产氢微生物的种类 22-23
1.2.2 微生物的产氢机制 23-28
1.2.3 氢酶的特点分类 28-30
1.2.4 生物制氢的关键技术 30-31
1.2.5 生物制氢的限制瓶颈 31-32
1.3 本文研究目的和内容 32-36
1.3.1 研究目的 32-33
1.3.2 研究内容 33-36
2 实验材料和方法 36-64
2.1 产氢菌种基因改造实验 36-47
2.1.1 材料和试剂 36-39
2.1.2 基因改造方法 39-41
2.1.3 实验设备 41-47
2.2 细菌氢酶活性测定 47-48
2.2.1 材料和试剂 47
2.2.2 实验装置 47-48
2.2.3 氢酶活性测定方法 48
2.3 混合产氢菌和产甲烷菌的培养富集 48-50
2.3.1 培养基的配制 49
2.3.2 混合菌群富集方法 49-50
2.4 发酵产氢及联产甲烷系统 50-56
2.4.1 实验室小试发酵系统 51
2.4.2 中试发酵系统 51-53
2.4.3 附属设备 53-56
2.5 发酵原料与产物的分析测定 56-64
2.5.1 发酵原料的TVS测定方法 56-57
2.5.2 还原糖的测定方法 57-58
2.5.3 有机物化学成分的测定方法 58
2.5.4 生物气成分与浓度测定方法 58-59
2.5.5 发酵液相副产物的测定方法 59-64
3 基因改造细菌的氢酶活性分析 64-72
3.1 引言 64-65
3.2 阴沟肠杆菌基因改造前后的氢酶活性 65-67
3.2.1 促进产氢蛋白HPP基因的过表达 65-66
3.2.2 E.cloacae CICC10017/HPP的氢酶活性 66-67
3.3 产气肠杆菌基因改造前后的氢酶活性 67-70
3.3.1 E.aerogenes氢酶操纵子大小亚基基因hycE和hycG的表达 67-68
3.3.2 E.aerogenes/HycE和E.aerogenes/HycG的氢酶活性 68-69
3.3.3 蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803氢酶hoxUYH基因的表达 69
3.3.4 E.aerogenes/HoxUYH的氢酶活性 69-70
3.4 本章小结 70-72
4 基因改造细菌的发酵产氢能力和代谢分析 72-84
4.1 引言 72
4.2 阴沟肠杆菌基因改造后的产氢特性和代谢分析 72-78
4.2.1 E.cloacae CICC10017/HPP的产氢特性 72-74
4.2.2 氮源对发酵产氢的影响 74
4.2.3 发酵液相副产物及代谢途径分析 74-78
4.3 产气肠杆菌过表达氢酶大小亚基基因后的产氢特性及代谢分析 78-80
4.3.1 E.aerogenes/HycE和E.aerogenes/HycG的产氢特性 78-80
4.3.2 发酵液相副产物及代谢途径分析 80
4.4 产气肠杆菌过表达蓝藻氢酶后的产氢特性及代谢分析 80-82
4.4.1 E.aerogenes/HoxUYH的产氢特性 80-81
4.4.2 发酵液相副产物及代谢途径分析 81-82
4.5 本章小结 82-84
5 基因改造细菌利用水葫芦的发酵产氢特性
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