【摘要】 研究背景自然流产指未使用人工方法,因某种原因胚胎或胎儿自动脱离母体而排出的现象。我国自然流产的发生率虽然低于世界上其他国家,但是增长趋势明显。自然流产的病因复杂,机制尚不明确,目前已知的病因有遗传因素、免疫因素、内分泌失调、解剖结构畸形、感染因素等,但仍有约50%的患者不能发现明确原因,称为原因不明自然流产(unexplained spontaneous abortion, USA)。连续发生2次或2次以上发生原因不明自然流产称为原因不明复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)。作为一种病理性妊娠,USA寸孕妇的生理及心理均产生不良的影响,对其病因及发病机制的研究有重要的意义。国内外研究表明高生育年龄、文化程度较低、从事接触有毒有害化学物质的职业、有自然流产史、孕次多及孕前肥胖等因素是USA发生的危险因素。同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的中间产物。研究表明HCY代谢异常可导致体内HCY水平升高,引起高HCY血症,从而产生胚胎毒性,还可导致凝血_—抗凝系统的平衡失调,引起胎盘栓塞,从而导致自然流产。有研究表明体内HCY水平异常升高可以使URSA发生的危险升高。叶酸是一种人体内不能合成必须完全依赖外援性供给的水溶性B族维生素,是HCY代谢过程中起重要生物学作用的辅酶。研究表明体内叶酸水平过低,可能导致HCY代谢过程出现障碍,引起高HCY血症,使URSA发生的危险升高。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)是HCY代谢过程中复甲基化过程的关键酶。该酶677位点存在胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的突变,使酶的活性降低,亦可导致HCY代谢过程出现障碍,引发高HCY血症。研究表明MTHFRC677T基因突变与体内HCY水平上升,叶酸水平下降有关。然而,上术对USA的危险因素的研究及与血清HCY水平、血清叶酸水平相关性的研究大多数是回顾性的病例对照研究,暴露信息资料收集及血清HCY、叶酸水平等指标的检测均在自然流产发生后进行,回忆偏倚不可避免,且血清学指标的检测结果并不能反映在自然流产发生之前体内血清标志物的真实水平。在此,研究结果在推论暴露因素、HCY及叶酸水平与USA的相关性时受到一定的限制。目前,MTHFRC677T基因多态性与血清叶酸水平、围孕期服用叶酸状况等因素在USA的发生危险中是否存在交互作用及交互作用的方式及强度如何,尚未见有相关研究报道。因此,本研究于201年1月～2012年2月在山东省两所妇幼保健医院建立以医院为基础的孕周≤10周的孕早期妇女观察队列,研究开始收集其人口学基本特征及有关暴露因素的信息,同时采集(?)清、抗凝血等生物学标本,追踪随访队列人群至妊娠结局进行随访研究。将从研究(?)始至随访结束收集到的经医院诊断的USA病例(包括URSA病例)纳入病例组,在观察队列人群中随机选择分娩正常足月儿的孕妇作为对照,进行1：4匹配巢式病例对照(?)究。研究目的1.探讨USA及URSA发生的危险因素：2.探讨孕早期血清HCY水平、血清叶酸水平与USA及URSA发生的关系；3.探讨MTHFRC677T基因多态性与USA及URSA发生的关系；4.探讨MTHFRC677T基因多态性与USA及URSA有关危险因素的交互作用及其(?)互作用的方式及强度；5.应用分类树分析法对USA发病风险预测模型进行初步探索。本研究通过对上述研究目的的探讨,旨在为USA病因机制的研究及防治措施的制定提供科学依据。研究方法1.建立以医院为基础的孕早期妇女观察队列：本研究于2011年1月-2012年2月(?)山东省两所妇幼保健医院按照纳入标准与排除标准建立孕周≤10周的孕早期妇女观察队列,研究开始收集人口学基本特征及有关暴露因素的信息,同时采集血清、抗凝血等生物学标本,追踪随访队列人群至妊妊娠结局。对观察队列人群进行随访研究探讨US。及URSA发生的危险因素。2巢式病例对照研究：将观察队列人群在研究期间发生的按照统一诊断标准确(?)的USA病例(包括lJRSA病例)纳入病例组,随机选择观察队列人群中分娩正常足月(?)的孕妇作为对照,按1：4的比例进行匹配,匹配的条件为同一居住地区、本次月经(?)间±2周。探讨血清HCY水平、叶酸水平及MTHFRC677T基因多态性与USA及URSA(?)生的关系,并采用分类树分析法构建USA发病风险预测模型。3.调查的内容及方法：研究对象进入观察队列时,采用面对面访谈的方式,收集基线资料及暴露因素的信息(包括一般人口学特征、孕前体重、围孕期服用叶酸状况等信息),同时采集研究对象血清及抗凝血标本冻存(-40℃)。随访结束收集有关妊娠结局的资料。4.实验室检测内容及方法：血清HCY水平检测采用循环酶法,血清叶酸水平检测采用直接化学发光法,MTHFRC677T基因多态性检测采用限制性片段长度多态性的方法进行基因分型。5.资料处理及统计分析方法：采用EpiData3.1软件进行数据双录入,核查无误后建立数据库。对变量予以赋值,导入SPSS20.0软件进行分析。单因素分析时计量资料组间的差异比较采用方差分析,计数资料组间率或构成比的差别比较采用χ2检验。多因素分析采用非条件logistic回归模型对观察队列随访研究的数据进行分析；采用条件logistic回归分析方法对匹配巢式病例对照研究的数据进行分析。基因与环境因素交互作用的分析采用多因子降维法及条件logistic回归模型两种方法。分类树分析法用于构建USA发病风险预测模型。研究结果1.从研究开始至随访结束,共纳入随访到妊娠结局的研究对象2098人。观察队列人群年龄平均值为27.08±3.87岁,最大年龄44岁,最小年龄20岁。研究对象进入观察队列时的孕周最大为10周,最小为1周,平均6.81±1.62周。研究对象中,初次怀孕者1240人,占59.10%,自然流产次数≥1次者占31.64%。研究期间收集到经医院统一标准诊断的USA病例160例,发生率为7.63%,其中URSA病例106例,发生率为5.05%。2.随访研究多因素分析结果显示,有自然流产史、既往胎次≥1次、孕前低体重、职业为农民、高生育年龄是USA发生的危险因素,比值比(odds ratio, OR)分别为12.521、6.942、2.099、1.765、1.069(P<0.05)。围孕期服用叶酸是USA发生的保护因素,OR值为0.635(95%CI：0.417,0.967)。职业为农民、既往胎次≥1次、孕前低体重、高生育年龄是URSA发生的危险因素,OR值分别为2.102、1.943、1.809、1.099(P<0.05),而围孕期服用叶酸URSA发生的保护因素,OR值为0.569(95%CI：0.342,0.949)。多因素分析研究结果显示,孕早期妇女围孕期服用叶酸的状况受年龄、职业、文化程度、自然流产史因素的影响。3.USA病病例组孕早期血清HCY水平的平均值(11.50μmol/L)显著高于对照组的平均值(9.48μmol/L), P<0.05。调整了混杂因素后,高HCY血症(≥15.0μmol/L)是USA发生的危险因素,OR值为2.694(95%CI:1.566,4.635). URSA病例例组血清HCY水平的平均值(11.02μmol/L)显著高于对照组的平均值(9.48μmol/L), P<0.05。调整了混杂因素后,高HCY血症是URSA发生的危险因素,OR值为2.154(95%CI:1.261,3.678)。4.USA病例组孕早期血清叶酸水平的平均值(8.91ng/ml)显著低于对照组的平均值(10.73ng/ml), P<0.05。调整了混杂因素后,与血清叶酸低水平(≤6.25ng/ml)相比,血清叶酸高水平(≥13.78ng/ml)是USA发生的保护因素,OR值为0.215(95%CI：0.102,0.415)。URSA病例组的血清叶酸水平的平均值(8.94ng/ml)显著低于对照组的平均值(10.41ng/ml),P<0.05。调整了混杂因素后,与血清叶酸低水平相比,血清叶酸高水平是URSA发生的保扩因素,OR值为0.280(95%CI：0.124,0.635)。5.USA及URSA病例组与对照组MTHFRC677T基因型的频率分布均有统计学差异。USA病例组TT基因型的频率为30.6%,显著高于对照组的频率17.7%(P<0.01)；病例组携带T基因型的频率为53.8%,显著训于对照组的频率44.3%(P<0.01)。URSA病例组TT基因型的频率为32.1%,显著高于对照组的频率16.1%(P<0.01)；病例组携带T基因的频率为52.8%,显著高于对照组的频率41.5%(P<0.01)。调整了混杂因素后,TT基因型与USA及URSA的发生均有统计学关联,OR值分别为1.891(95%CI：1.172,3.049)及2.488(95%CI：1.505,4.113)。6. MDR法分析结果显示,对于USA的发病危险,孕前低体重和血清叶酸水平之间存在变互作用,且表现为较强的拮抗效应,加入TT基因型这个因素后,期拮抗效应减弱。对于URSA的发病危险,TT基因型与围孕期服用叶酸之间存在交互作用,且表现为较强的拮抗效应,加入血清叶酸水平这个因素后,其拮抗效应减弱。条件logistic回归模型分析结果显示,对于USA的发病危险,TT基因型分别与围孕期未服用叶酸、孕前低体重、血清叶酸中低水平存在相加模型交互作用,效应指教(S)分别为3.31、7.69、1.95,归因交互效应百分比(AP)分别为52.7%、76.3%、41.3%,且引起的交互效应超额相对危险度(RERI)分别为2.16、6.19、2.68；对于URSA的发病危险,TT基因型分别与围孕期未服用叶酸、孕前低体重、血清叶酸中低水平存在正相加模型交互作用,S分别为2.58、5.81、1.66,AP分别为41.2%、72.3%、35.4%,且引起的RER1分别为1.26、5.71、3.26。7.USA影响因素的分类树分析结果显示,有自然流产史、既往胎次≥1次、血清叶酸水平、年龄、围孕期服用叶酸5个因素在USA的发病风险中起重要的作用,其中自然流产史是对USA发病风险影响最大的因素。对该分类树发病风险预测模型进行评估发现,对USA发病风险预测的正确概率为81.5%,根据模型预测概率绘制受试者工作特征(ROC)曲线,曲线下的面积为0.833(95%CI：0.801,0.865)。说明该模型对USA发病风险的预测价值较高,预测效果较好。研究结论1.既往胎次≥1次、孕前低体重、职业为农民、高生育年龄是USA及URSA发生的危险因素,围孕期服用叶酸是USA及URSA发生的保护因素。有自然流产史的妇女发生USA的高危人群。2.孕早期高HCY血症可以使USA及URSA发生的危险性分别增加约1倍及1.5倍。与孕早期血清叶酸低水平相比,血清叶酸高水平可以使孕妇USA及URSA发生的危险降低。3. MTHFRC677T基因多态性与USA及URSA的发生有关。与CT/CC基因型相比,TT基因型可以使USA及URSA的发生危险分别升高约1.5倍。MTHFRC677T TT基因型与围孕期未叶酸服用、孕前低体重及血清叶酸中低水平三个因素在USA及URSA的发生危险中有协同作用。4.在USA的发病风险预测模型中,有自然流产史、既往胎次≥1次、血清叶酸水平低、高生育年龄及围孕期未服用叶酸5个因素起着重要的作用,具有这些特征的孕早期孕妇可能是USA发病的高危人群。研究的创新之处：1.采用前瞻性随访研究的方法探讨了USA及URSA发生的危险因素。本研究建立以医院为基础的孕早期妇女观察队列,随访至妊娠结局,得到了队列人群USA的发病率,与传统的病例对照研究相比,回忆偏倚较小,因果关系论证强度较高。2.采用J匹配巢式病例对照研究的方法探讨了孕早期妇女血清HCY水平、血清叶峻水平与USA及URSA发生的关系。与传统的病例对照研究方法相比,具有较高的统计效率和检验效率,研究的外部真实性及因果关系论证强度较高。研究发现在调整了年龄、职业、围孕期服用叶酸等可能的混杂因素后,孕早期高HCY血症使USA及URSA发生的危险性分别增加约1倍及1.5倍,孕早期血清叶酸高水平是USA及URSA发生的保护因素。3.将多因子降维法应用于对MTHFRC677T基因多态性与围孕期服用叶酸、孕前低体重及血清叶酸水平之间的交互作用分析中,并与条件logistic回归模型分析方法联合应用。研究发现MTHFRC677TTT基因型与围孕期未服用叶酸、孕前低体重及孕早期血清叶酸中低水平在USA及URSA的发生危险中分别存在协同作用。 
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