【摘要】 细菌性脑膜炎被认为是全球前十大致死性感染性疾病之一,致死、致残率高,目前仍约30-50%的患者留有不可逆转的神经系统后遗症。血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)通透性增加致血管源性脑水肿在其发病中起关键作用,发病机制未明,治疗较困难。因此阐明细菌性脑膜炎时BBB通透性改变及调控机制有非常重要的实用意义。研究表明脑微血管内皮细胞(brain micro vascular endothelial cells, BMECs)及紧密连接(tight junction, TJ)是BBB结构和功能的主要基础。LPS为革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分,释放入血后被称为内毒素,对BBB屏障功能破坏有重要作用。我们团队的前期实验证实中枢神经系统感染性时LPS表达显著升高,且可引起BEMC紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达下调,但其具体的调控方式不明。目前研究显示PKC、Rho、PI3K和酪氨酸激酶以及核转录因子NF-κB均可能参与调控紧密连接的组装和分解,维持内皮细胞低通透性。但对于上述信号分子是否参与细菌性脑膜炎或感染性脑损伤时LPS致BBB通透性升高的调控过程,他们之间的调控关系如何等方面的研究均少见报道。对上述问题的深入研究,有助于进一步阐明感染性脑损伤时BBB通透性增高的病理过程和发病机制,为其临床防治提供新的思路。本研究分为四部分：第一章永生化Bend.3细胞株具有原代鼠脑微血管内皮细胞屏障特性目的：评价永生化小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3是否具有原代培养的鼠脑微血管内皮细胞的屏障及生理特性。方法：将小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3和原代培养的鼠脑微血管内皮细胞接种于细胞培养插内,跨内皮细胞电阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)通透性实验检测其屏障功能。Westernblot法和直接荧光染色法观察其紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1的表达及细胞骨架蛋白F-actin的分布。结果：Bend.3细胞的TEER随培养时间延长逐渐升高,10d达82.33±6.03Ω·cm2,与培养3d时相比,差异有统计学意义(P<0.05),与同期原代培养的鼠脑微血管内皮细胞的TEER相比,无明显差异(P>0.05)。Bend.3细胞培养10d和3d的平均HRP通透率在120min分别为(2.±20.05)%和(4.3±0.20)%,差异有统计学意义(P<0.05),与同期原代培养的鼠脑微血管内皮细胞的TEER相比,无明显差异(P>0.05)。培养10d时Bend.3细胞和原代培养的鼠脑微血管内皮细胞均表达高浓度的紧密连接蛋白Occludin、ZO-1,且F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,未见明显缝隙形成。结论：小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3具有原代培养的脑微血管内皮细胞的屏障特性,且其屏障功能在接种10d后可达到最理想的状态。第二章初步筛选脂多糖致脑微血管内皮细胞通透性改变的信号分子目的：证实脂多糖通过引起Actin重组、紧密连接表达和分布变化导致脑微血管内皮细胞通透性增高,初步探讨PKC、Rho、PI3K和酪氨酸激酶等信号是否参与脂多糖致脑微血管内皮细胞通透性改变的调控。方法：运用TEER测定法、F-actin染色法、western blot和免疫荧光法分别检测了LPS作用不同时间下Bend.3细胞的通透性,F-actin分布以及紧密连接蛋白cluaudin-5,Occludin和ZO-1的状态,以动态观察LPS是否通过破坏紧密连接蛋白增加脑血管内皮细胞通透性,然后分别利用calphostin C (PKC抑制剂)、C3transferase (Rho抑制剂)、wortmannin (PI3K抑制剂)、PP2(酪氨酸激酶抑制剂)预处理Bend.3细胞,再通过TEER检测LPS对各组细胞屏障功能的影响,了解PKC、酪氨酸激酶、PI3K、Rho信号是否参与了LPS致血脑屏障通透性升高的调控过程。结果：LPS可致Bend.3细胞TEER以时间依赖性的方式下降,同时伴有紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达下调,Claudin-5蛋白分布改变,以及细胞骨架F-actin重组。PKC、Rho抑制剂可改善LPS引起的Bend.3细胞TEER下降；而PI3K、酪氨酸激酶抑制剂不能阻断LPS对Bend.3屏障功能的破坏。结论：脂多糖引起脑微血管内皮细胞Actin重组、紧密连接表达和分布变化而导致其通透性增高；PKC和Rho,而非PI3K和酪氨酸激酶,参与了此过程调控。第三章PKC和RhoA信号相互作用调控脂多糖致脑微血管内皮细胞通透性升高过程目的：探讨PKC各亚型(α、β和ζ)如何参与脂多糖致脑微血管内皮细胞通透性升高调控过程,他们与RhoA之间的调控关系如何。方法：1.pull-down法和免疫共沉淀结合体外酶学实验法分别检测LPS作用不同时间Bend.3细胞的RhoA和PKC各亚基(α、β和ζ)活化状态。2.分别利用脂质体2000将PcDN A3.1hygro-n19RhoA、 PcDNA3.1hygro-vector(空载对照质粒)导入Bend.3细胞,利用潮霉素B筛选出稳定表达株。Pull Down法鉴定RhoA活性的抑制情况。并将PLKO.1-puro-PKCα-shRNA、PLKO.1-puro-PKCβ-shRNA PLKO.1-puro-PKCζ-shRNA和empty PLKO.1-puro vector导入Bend.3细胞,利用嘌呤霉素B筛选出稳定表达株。Western blot分别鉴定PKC-α PKC-β和PKCζ蛋白的表达抑制情况。并根据导入质粒不同分5组,运用F-actin染色法、western blot和免疫荧光法分别检测了LPS作用不同时间下各组Bend.3细胞F-actin分布以及紧密连接蛋白cluaudin-5,Occludin和ZO-1的状态,以了解抑制RhoA及PKC亚基(α、β和ζ)后LPS致紧密连接破坏作用的改变。3.利用N19RhoA和C3转移酶抑制RhoA活性后,体外酶学法检测LPS对PKC各亚基活化作用；利用shRNA分别抑制PKC-α、PKC-β和PKC-ζ活性后Pull Down法分别检测各组LPS对RhoA活化作用,以初步探讨PKC各亚型与RhoA调控关系；为进一步确认在LPS致BBB屏障功能破坏过程中PKC-α是否为RhoA上游分子信号,抑制PKC-a活性后,比较稳定表达N19RhoA和vector-1质粒的两组Bend.3细胞在LPS作用前后的TEER值变化；为明确PKC-ζ和RhoA在LPS致BBB屏障功能破坏过程中的调控关系,抑制稳定表达PKCζ-ShRNA和vector-2的Bend.3细胞的RhoA活性,比较其在LPS作用前后的TEER值的改变。结果：1.LPS作用5min RhoA及PKC各亚型(α、β和ζ)均开始活化。2.成功建立稳定表达PKC-ακ、PKC-β、PKC-ζ及N19RhoA的Bend.3细胞株。分别抑制RhoA及PKC各亚型(α、β和ζ)均可改善LPS对Bend.3细胞TJ的破坏作用。3.PKC-ζ活性受RhoA调控,RhoA活性受PKC-α调控,且在LPS致Ben.3细胞通透性上升调控过程中,PKC-ζ PKC-α分别是RhoA的下游及上游调控信号。结论：PKC各亚基(α,β,ζ)和RhoA活化均促使BBB-TJ开放而导致BBB通透性上升,其中PKC-a、PKC-ζ分别为RhoA的上游调控分子和下游调控事件。第四章RhoA/NF-κB/MLCK信号参与调控脂多糖致脑微血管内皮细胞通透性升高过程目的：探讨RhoA/NF-κB/MLCK信号是否参与LPS致BBB通透性升高的调控。方法：利用脂质体2000将DNMu-IκBa质粒导入Bend.3细胞,潮霉素B筛选出稳定表达株。报告基因法鉴定NF-κB活性的抑制情况。首先为了解RhoA和NF-κB是否参与LPS致BBB通透性升高的调控：利用pull down法和荧光素酶报告基因法分别测定LPS对Bend.3细胞的RhoA和NF-κB的活化作用。同时比较LPS对稳定表达N19RhoA和DNMu-IκBa质粒的Bend.3细胞的通透性、F-actin分布以及紧密连接蛋白表达分布等指标的影响。为明确上述过程中NF-κB是否由RhoA活化而激活,进一步比较了LPS作用不同时间,Bend.3细胞、稳定表达Vector-1和N19RhoA质粒的Bend.3细胞的NF-κB活性变化,同时比较了LPS对Bend.3细胞、稳定表达Vector-1和DNMu-IκBα质粒的Bend.3细胞的RhoA活性的影响。最后,为阐明上述过程中NF-κB是否通过增加MLCK转录,导致肌球蛋白轻链(Myosin light Chain, MLC)磷酸化,本研究利用western blot及RT-PCR分别检测了MLC磷酸化和MLCK转录水平。结果：稳定表达DNMu-IκBα和N19RhoA质粒均可改善LPS致Bend.3细胞紧密连接破坏、通透性升高的作用。LPS作用5min RhoA活化,作用30min NF-κB活化；抑制RhoA活化,LPS致NF-κB活化的作用也被明显抑制,但抑制NF-κB活化对RhoA活性水平无影响。LPS作用0.5h, MLCK转录水平上升,3h MLC磷酸化水平明显增高,阻断NF-κB活化后上述表现被抑制。结论：RhoA/NF-KB/MLCK信号通过磷酸化MLC,参与了LPS致BBB-TJ破坏、通透性升高过程的调控。 

 

【关键词】 紧密连接； 蛋白激酶C； NF-κB； RhoA； 血脑屏障； 通透性；