大鼠急性脊髓损伤后皮层微管相关蛋白1 轻
链3 的表达及药物干预#
林建华1，王振宇2，吴朝阳1*
基金项目：2011 年福建省卫生厅青年科研基金资助项目（2011-2-7），高等学校博士学科点专项科研基金
（20060392003）
作者简介：林建华，（1955-），男，主任医师，教授，研究方向：骨肿瘤及脊柱脊髓外科. E-mail:
wzydz@hotmail.com
5 （1. 福建医科大学附属第一医院，福州 350005；
2. 福建医科大学附属协和医院，福州 350001）
摘要：【目的】 研究大鼠急性脊髓损伤后损伤区的皮层微管相关蛋白1 轻链3（LC-3）的
表达及雷帕霉素（rapamycin）的干预作用。【方法】 成年SD 大鼠90 只按照随机数字表法
分成3 组，每组30 只。手术组用改良Allen 法建立急性脊髓损伤模型，对照组同法暴露脊
10 髓但不造成脊髓冲击伤。Rapamycin 组于脊髓损伤前4 小时腹腔注射25mg/ml 的Rapamycin。
3 组大鼠于建模后1h、8h 、24h、 3d、7d、14d 为时间点处死取材，采用Western blot 分
别检测3 组大鼠脊髓损伤区LC-3 的表达。【结果】 与对照组同一时间点相比，手术组脊髓
损伤区组织中LC-3 的表达明显增多，差异均有统计学意义(P<O．05)。与手术组同一时间点
相比．Rapamycin 组LC-3 的表达明显增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。【结论】 脊髓
15 急性损伤后自噬途径被激活．Rapamycin 参与了自噬途径的调控。
关键词：脊髓损伤；大鼠；自噬；LC3；雷帕霉素
 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种可以致残的严重损伤，给患者家庭及社会带
来沉重负担。脊髓损伤后中枢神经细胞发生一系列细胞和分子事件,包括炎症反应、坏死和
凋亡。除了损伤部位的原发性损伤外,近来越来越多的研究结果表明,继发性损伤在急性脊髓
 45 损伤后扮演了重要角色,而凋亡是引起脊髓继发性损伤的主要机制。如何有效抑制神经细胞
的凋亡已成为SCI 治疗的研究热点。自噬（autophagy）是细胞的一种高度保守降解途径[1]，
最近研究发现，在神经元发生细胞死亡的过程中，自噬先于凋亡，在控制神经细胞死亡中具
有重要的调节作用[2]。微管相关蛋白1 轻链3（LC3）是自噬体膜上的标志性蛋白，通过检
测LC3 能证实自噬现象的发生[3]。雷帕霉素（rapamicin）作为mTOR 的抑制剂，能使自噬
50 特异性蛋白磷酸化酶模式发生转换，有助于Atg13 去磷酸化、Atg1 活化和Atg8 水平升高，
促进自噬发生[4]。本研究在制作大鼠脊髓急性损伤模型的基础上，采用免疫印迹方法检测大
鼠急性脊髓损伤后及雷帕霉素干预后脊髓LC3 表达的变化，以期进一步揭示自噬激活在脊
髓损伤中的作用。
1 材料和方法
55 1.1 材料与仪器
Anti-LC3(CST 公司)；RIPA 裂解液、BCA 法蛋白定量试剂盒及UltraECL 底物化学发
光检测试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；β-actin 一抗及HRP 标记的羊抗鼠的二抗(中
杉金桥公司)；垂直蛋白电泳槽（Amersham Biosciences MiniVE Complete）；电泳仪（Amersham
Biosciences EPS 301）；Rapamycin（美国sigma 公司）。
60 1.2 实验方法
1.2.1 模型制作
大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉,俯卧固定，按照文献报告，暴露T10 段脊髓，采用改良
Allen 法，致伤量为50 g/cm，造成T10 段脊髓的冲击伤。脊髓损伤模型造模成功的标志：
在Allen 装置撞击脊髓的瞬间，动物身体抖动，双下肢迅速发生回缩及弹动动作，尾巴翘起
65 并迅速倒下，打击局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，术后双下肢出现完全瘫痪。假手术组大鼠同
法暴露T10 段脊髓，不造成脊髓冲击伤。
1.2.2 实验分组
成年健康雌性Sprague—Dawley 大鼠90 只，体质量200-220g，（上海斯莱克实验动物
有限责任公司提供）。大鼠按照随机数字表法分成手术组、假手术组（正常对照）和Rapamycin
70 组，每组各30 只，以脊髓损伤模型建立后1h、8h 、24h、 3d、7d、14d 为时间点，随机分
为6 个亚组，每亚组5 只。Rapamycin 组于脊髓损伤前4 小时腹腔注射25mg/ml 的Rapamycin，
按2.5ml/kg 给药。大鼠喂养条件：22～25℃，12 小时昼夜循环，可自由进食饲料和饮水的
动物房。术后定期给大鼠膀胱挤尿。
1.2.3 组织取材
75 各时相点大鼠5 只，于相应时相点麻醉后，迅速取出脊髓，按照每20mg 组织加入150ul
裂解液的比例加入裂解液，充分裂解后，10000-14000g 心5 分钟，提取上清，BCA 法测蛋
白浓度，使得各组裂解液中蛋白质的浓度达到一致，样品按4:1 加入5×上样缓冲液，进行
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，浓缩胶恒压90V，约20min；分离
胶恒压120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部，5%脱脂奶粉封闭1 h 后，加入l：400 的兔抗鼠
80 LC3 孵育，摇床上振摇1h，TBST 洗膜3 次，每次10min ，再加入1：5000 HRP 标记的羊
抗兔IgG 孵育，摇床上振摇1h，TBST 洗膜5 次，每次10min ，ECL 试剂显色、曝光，应
 用Image-Plus 软件半定量分析Western blot 条带吸光度，相对表达量以各样本条带吸光度值
与内参β-actin 条带吸光度值的比值计算。
1.3 统计学分析
85 所有数据经过方差齐性检验和正态性检验，实验数据用均数±标准差（ x ± s ）表示，
采用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析，各组间比较采用t 检验，p<0.05 表示差异具
有统计学意义。
2 Western Blot 结果
各个时相点的样本在特定的位置均可发生特异的免疫染色反应，与对照组同一时间点相
90 比，损伤组脊髓中LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的表达明显增多，差异均有统计学意义（ P＜0.05 ）。与
损伤组同一时间点相比，雷帕霉素组脊髓中LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的表达明显增多，差异均有统计
学意义（ P＜0.05 ）(表1，图1)。
表1 3 组大鼠不同时相点脊髓损伤区LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ/β-actin 值（ x ± s ）
组别 1h 8h 24h 3d 7d 14d
对照组 0.137±0.012 0.137±0.006 0.143±0.015 0.147±0.006 0.145±0.015 0.150±0.010
手术组 0.176±0.017 0.216±0.026 0.374±0.027 0.588±0.032 0.522±0.031 0.342±0.032
雷帕霉素
组
0.206 ±
0.027&
0.298 ±
0.037@
0.410 ±
0.021&
0.710 ±
0.042@
0.600 ±
0.050@
0.388 ±
0.026&
F 值 10.522 30.378 140.684 277.899 145.397 80.433
P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01
95 &与手术组比较P＜0.05；@与手术组比较P＜0.01
3 讨论
100 自噬是细胞在生命进化过程中的一种高度保守降解途径，主要通过形成双层膜结构来包
裹泛素-蛋白酶体途径无法降解的一些长寿蛋白质、生物膜、线粒体、核糖体、内质网及过
氧化物酶体等细胞器形成自噬体，转运到溶酶体并与之结合形成自噬溶酶体，降解成有生物
活性的小分子，并将这些小分子重新利用，以维持细胞内环境稳定[5]。细胞缺乏营养时，自
 噬被激活，通过诱导自噬体形成，并和溶酶体融合来降解膜磷脂和胞质内蛋白质等，这有助
105 于为细胞提供营养和维持细胞生命活动所需的能量。当生长因子缺乏时，细胞不能很好的利
用外源性营养物质，同时，由于生长因子缺乏会导致细胞表面与营养转运有关的受体合成受
影响，比如葡萄糖受体、低密度脂蛋白受体、氨基酰转运蛋白及转铁蛋白等相应减少。此时，
细胞的营养摄取能力也受到了影响。所以当细胞生长因子缺乏时，细胞的外源性营养利用和
摄取能力受到影响，通过上调自噬活性可以向细胞提供所需的能量和营养。此时，自噬对维
110 持细胞的生存是必需的。当细胞处于结构重塑如在发育过程中，或细胞要清除受损的胞浆内
容物，如在氧化应激，感染，蛋白凝聚物聚集等情况下，自噬也会明显的上调。营养状况，
激素因子，以及温度，氧浓度，细胞密度等因素对细胞的自噬也有影响[6]。
现在已有很多方法检测自噬的活性，其中使用免疫印迹法检测LC3II／LC3I 的表达情况
是最常用的方法。微管相关蛋白1 链3 是一个分子量接近17kDa 的可溶性蛋白，广泛分布
115 于哺乳动物的组织和细胞中。在自噬过程中，自噬体吞噬胞质内容物，包括胞浆蛋白和细胞
器。与此同时，LC3 前体形成后，首先加工成胞浆可溶性形式LC3I(18kDa)端的甘氨酸残基。
同样，LC3I 也被At97 活化，转运至第二种E2 样酶At93，并被修饰成膜结合形式
LC3II(18kDa)。LC3II 定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。因为LC3Ⅱ
的数量与自噬体的数量成正相关。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3II 即被溶酶体
120 中的水解酶降解。在前期工作中我们利用大鼠脊髓急性损伤模型，在电镜下发现不同时间点
大鼠的损伤脊髓神经元细胞都有自噬体的表达，且数量随时间而增加，说明大鼠脊髓损伤后
自噬被激活并且可能发挥重要的作用。本实验中我们通过Western Blot 的方法检测到：正常
对照组损伤区脊髓组织中LC3II / LC3Ⅰ的蛋白含量较少，脊髓损伤后各个时间点LC3Ⅱ/
LC3Ⅰ的蛋白表达明显升高（p＜0.05，在第3d 时达到高峰，与前期实验结果一致，说明脊
125 髓损伤后损伤区的细胞启动自噬细胞死亡，并在第3D 的时候达到高峰。通过上述实验结果，
我们认为脊髓损伤后自噬的激活可能与脊髓损伤后神经细胞的自我保护机制有关，这已经在
脑外伤和脑缺血的模型中得到了验证。Diskin 等[2]首次通过建立大鼠自由落体脑外伤模型研
究证明。自噬在脑外伤后4h 开始表达，l 周时达到高峰，持续3 周左右；自噬相关基因表达
物Beclin—l 在神经元、星形胶质细胞均有表达。他们发现在发生自噬的神经元内同时表达
130 凋亡，脑外伤早期自噬增多、凋亡减少，表明脑外伤早期自噬被明显激活，对抗凋亡，保护
受损神经细胞。Komatsu 等[7]用自噬基因Atg7 缺失的大鼠进行中枢神经系统缺血、缺氧实
验，结果证实不发生自噬。大脑和小脑皮质大部分神经元细胞死亡，泛素聚集于神经元细胞
周围，且随时间延长而增多，但蛋白酶体功能无明显改变，从而证明自噬对神经元细胞的存
活具有保护作用。
135 雷帕霉素( rapamycin)是一种亲脂性大环内酯类抗生素, 1999 年由美国FDA 认证,是已被
证实的自噬激活剂。雷帕霉素的下游靶点mTOR 是一种分子质量为289 ku 的丝/苏氨酸蛋白
激酶,是磷脂酰肌醇激酶3 /蛋白激酶B ( PI3K/Akt) 和丝/苏氨酸激酶11(LKB1)能量敏感型通
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