SIRT1 对肿瘤坏死因子-alpha 诱导的3T3-L1
脂肪细胞中CD40 表达的影响#
林琴琴，林蓉，张继业，王维蓉，杨丽娜，张凯帆**
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20090201110050）
作者简介：林琴琴，（1982-），女，博士研究生，主要从事动脉粥样硬化炎症因子的基础研究。
通信联系人：林蓉，（1963-），女，教授，主要从事心血管疾病炎症机制研究. E-mail: linrong@mail.xjtu.edu.cn
5 （西安交通大学医学院药理学系，西安 710061）
摘要：目的：探讨SIRT1 对肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 诱导的3T3-L1 脂肪细胞中CD40 表
达的影响及其可能机制。方法：培养3T3-L1 前体脂肪细胞，诱导分化成为成熟脂肪细胞。
免疫细胞化学方法检测SIRT1 在3T3-L1 成熟脂肪细胞中的表达定位；实时定量聚合酶链式
反应 (Real-time PCR) 和蛋白质印迹方法检测不同时间和不同浓度的TNF-α对3T3-L1 成
10 熟脂肪细胞中CD40 基因及蛋白表达的影响；用SIRT1 相关信号通路激动剂或阻断剂探讨
SIRT1 调节CD40 表达改变的信号转导机制。结果：SIRT1 在3T3-L1 脂肪细胞的细胞核和细
胞质中均有表达。TNF-α对3T3-L1 脂肪细胞中CD40 的诱导作用呈浓度依赖性，随着浓度增
加 (0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml), CD40 基因和蛋白表达显著升
高，在10 ng/ml 时刺激最强，差异显著 (P < 0.01), 所以本实验以10 ng/ml 的剂量作为
15 TNF-α 最佳刺激浓度； 10 ng/ml TNF-α刺激下3T3-L1 脂肪细胞内CD40 基因和蛋白表达
改变呈时间依赖性， 随着时间的延长时间的延长(0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h) 而增高 (分
别为P< 0.01, P< 0.001, P< 0.001, P< 0.001 )。进一步的信号转导通路研究显示SIRT1
在3T3-L1 脂肪细胞中通过NF-κB 通路调节TNF-α诱导的CD40 的表达。结论：在3T3-L1
脂肪细胞中通过NF-κB 通路调节TNF-α 诱导的CD40 的表达。
20 关键词：肿瘤坏死因子-α；SIRT1; CD40; 3T3-L1 脂肪细胞
  45 0 引言
Sirtuin 1（SIRT1）是一个沉默信息调节酵母2 的家庭属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖
的III 类组蛋白去乙酰化酶[1]。近年研究发现，SIRT1 活化可通过调节脂肪细胞产生的促炎
性细胞因子在肥胖相关的心血管疾病中发挥重要作用[2-4]。CD40 是一个属于肿瘤坏死因子受
体家族的45 kD 的整合膜蛋白。研究证实，CD40 在肥胖有关的心血管疾病的各种炎症过程
50 的发生和发展中起着重要作用[5,6]。CD40 广泛存在在各种细胞中，除了内皮细胞，平滑肌细
胞，肥大细胞和小胶质细胞等细胞外，近来研究证实，CD40 也在人脂肪细胞和小鼠3T3-L1
脂肪细胞系中表达，且重组CD40L 激活CD40 可通过MAPK 信号通路显著增加人脂肪细胞
中炎性细胞因子如IL - 8，MCP - 1 和PAI-1 的表达, 提示脂肪细胞产生的CD40 分子在与肥
胖有关的炎症反应中扮演重要角色[7-9]。虽已报道，SIRT1 通过调节促炎脂肪细胞因子在肥
55 胖相关的心血管疾病中发挥着积极的作用，但SIRT 对脂肪细胞中炎症因子CD40 的作用目
前报道尚少。因此，本研究着重探讨SIRT1 对TNF-α 诱导的3T3-L1 脂肪细胞中CD40 表
达的影响及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
60 3T3-L1 前脂肪细胞株购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，高糖
DMEM 培养基（美国，GIBCO 公司），胎牛血清（美国，Hyclone 公司）。重组TNF-α
（美国，PeproTech 公司），1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、牛血清白蛋白、
白藜芦醇、尼克酰胺、SIRT1 特异性抑制剂Sirtinol、PDTC（美国，Sigma 公司）。 Trizol
(美国，Invitrogen 公司)，逆转录试剂盒、SYBR GreenⅠ荧光染料（美国，Fermentas 公司），
65 引物（北京奥科鼎盛生物科技有限公司）。兔抗小鼠CD40 多克隆抗体（美国，Santa Cruz 公
司），内参β-actin（北京博奥森生物技术有限公司），山羊抗兔IgG（北京赛诺博生物技术
中心）。
1.2 细胞培养
3T3-L1 前脂肪细胞接种于培养板，用含10% 胎牛血清的DMEM 培养液在37℃、5%
70 的CO2 条件下培养，待细胞融合2d 后，加含0.5mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、1μmol/L
地塞米松、10 μg/ml 胰岛素和10% 胎牛血清的高糖DMEM 培养48h，换以含10 μg/ml 胰
岛素的培养液再培养48h，随后以10 % 胎牛血清高糖DMEM 继续培养，2d 换培养液1 次，
诱导分化8~10d 的3T3-L1 细胞90% 以上呈脂肪细胞表型，可用于实验。
分组: 将上述分化成熟的3T3-L1 脂肪细胞加TNF-α 处理。为选择TNF-α 最佳刺激剂量，
75 以不同浓度TNF-α (0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml)刺激脂肪细胞细胞12 h。
为测定TNF-α 对脂肪细胞中CD40 的刺激是否具有时间依赖性，选择不同时间点（0 h，4 h，
8 h，12 h, 24 h）刺激细胞。为了研究TNF-α 刺激脂肪细胞表达CD40 的信号通路，对实验
进行分组：①正常未处理组；②TNF-α 单独刺激组；③TNF-α+白藜芦醇；④TNF-α+尼克酰
胺；⑤TNF-α+ Sirtinol；⑥TNF-α+ PDTC, 收集细胞后进行下一步的实验。
80 1.3 免疫荧光染色
取出细胞爬片，用预温的PBS 洗3 次，后用4 %多聚甲醛室温固定30 min，PBS 洗3
次，加0.5% Triton-100 透 化5 min，再PBS 洗3 次，然后5 % BSA 室温封闭 30 min，
 最后分别加SIRT1 一抗（用PBS 1∶50 倍稀释），放湿盒中4 ℃过夜；第2 天，先用PBS 洗
3 次，然后加入FITC 标记的山羊抗兔IgG（用PBS 1∶50 倍稀释），室温避光孵育2 h，
PBS 洗85 3 次，最后DAPI 复染细胞核（用PBS 1∶2500 倍稀释），室温避光孵育20min，
PBS 洗3 次，95 %甘油封片，荧光显微镜检测。
1.4 蛋白提取和蛋白质印迹 (Western blot)
消化收集细胞，4℃预冷的裂解液裂解细胞，BCA 法测定蛋白浓度，取40 μg 总蛋白样
品，与上样缓冲液混匀后100℃煮沸5 min，得到进行Western Blot 的蛋白样品，进行聚丙
90 烯酰胺凝胶电泳。按湿转法将电泳产物转移到PVDF 膜, 5%脱脂奶粉室温封闭2 h, 滴加一
抗兔抗小鼠多克隆抗体CD40 和SIRT1 (1:200), 4℃过夜, TBST 洗膜10 min × 4 次, 滴加二
抗 (1:10000) 37℃孵育1h, TBST 洗膜10 min ×4 次, 按ECL 试剂盒说明进行显色, GelDoc
凝胶成像仪采集图像。
1.5 实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）
95 每瓶细胞中加入1 ml Trizol 试剂，按常规方法提取RNA，紫外分光光度计测定核糖核
酸A260/A280 的比值及RNA 浓度。取3μg 3T3-L1 脂肪细胞的总RNA，根据逆转录试剂盒说
明书操作合成单链脱氧核糖核酸（cDNA）。参照Genebank 提供的序列号和种属合成小鼠
CD40, SIRT1 和内参磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)引物序列。CD40 引物序列上游：
5'-TGTGATTTGTGCCAGCCAGG-3', 下游：5'- AACCCGAAGCCCTTGATTGG-3'，预期扩
100 增长度162 bp。GAPDH 引物序列上游：5'- CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3', 下游：
5'-GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3'，预期扩增长度195 bp。选用25μl 反应体系，包括上
下游引物各0.75μl，DEPC 水10.75μl，SYBR GreenⅠ12.5μl，cDNA 0.15μl。反应条件：95
℃ 10min (1 个循环)；95℃ 15s，60℃ 30s, 72℃ 30s (40 个循环)。利用2－△△Ct 法分析基因
相对表达量。结果重复3 次。
105 1.6 统计学分析
数据分析采用SPSS 15.0 软件，实验结果用⎯x ± s 表示，多组均数比较采用ANOVA 方
差分析。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SIRT1 在3T3-L1 脂肪细胞中的表达定位
110 如图1 所示，SIRT1 蛋白位于细胞质和细胞核中为绿色荧光，细胞核染色为蓝色荧光。
图1 免疫荧光检测SIRT1 在3T3-L1 脂肪细胞中的表达
Fig.1 The expression of SIRT1 protein in 3T3-L1 adipocytes detected by immunofluorescence staining.
 2.2 TNF-α 刺激对3T3-L1 脂肪细胞CD40 基因和蛋白表达呈浓度依赖性
115 3T3-L1 脂肪细胞诱导分化成熟后，换无血清培养基静息12 h 后加TNF-α 刺激，随着
TNF-α 浓度升高 (0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml)，CD40 蛋白和基因表达显
著增加，在10 ng/ml 时表达显著升高，差异显著 (P < 0.01)。（图2）
图2 TNF-α 在不同浓度下刺激3T3-L1 成熟脂肪细胞CD40 基因和蛋白的表达
120 Fig.2 Dose-dependent effects of tumor necrosis factor-α on CD40 gene and protein expression.
Compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01 and *** P < 0.001, n=4.
2.3 TNF-α 刺激对3T3-L1 脂肪细胞CD40 基因和蛋白表达呈时间依赖性
Real-time PCR 和Western blot 分别检测CD40 基因和蛋白表达情况，TNF-α 刺激后，
125 随着TNF-α 时间增加（0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h），CD40 蛋白和基因表达显著增加，差异均
有统计学意义 (P < 0.01)。（图3）
图3 TNF-α调节3T3-L1 成熟脂肪细胞CD40 基因和蛋白的表达变化。
Fig.3 Time-dependent effects of tumor necrosis factor-α on CD40 gene and protein expression.
130 Compared with control group, **P < 0.01 and *** P < 0.001, n=4.
2.4 SIRT1 调节脂肪细胞中TNF-α 诱导的CD40 的表达
刺激8 h 后检测CD40 蛋白和基因表达，结果显示，应用SIRT1 激动剂白藜芦醇显著下
调CD40 蛋白和基因的表达，SIRT1 抑制剂尼克酰胺和特异性抑制剂Sirtinol 显著上调CD40
135 蛋白和基因的表达, NF-κB 抑制剂PDTC 显著下调CD40 蛋白和基因的表达。（图4）
 图4 SIRT1 调节脂肪细胞中TNF-α诱导的CD40 基因和蛋白的表达变化。
Fig.4 SIRT1 regulates the expression of CD40 induced by TNF-αin 3T3-L1 adipocytes via NF-κB pathway
Compared with TNF-α group, *P < 0.05, **P < 0.01 and *** P < 0.001, n=4.
140
3 讨论
越来越多的证据表明，低度慢性炎症与肥胖相关心血管疾病的发生发展密切相关[10]。
CD40 在多种炎症过程的发生和进展过程中起着至关重要的作用。研究证实，在炎症过
程中，TNF-α 可显着促进并增加各类细胞中CD40 的表达及其下游信号转导通路[11,12]。研究
145 已证实，TNF-α 可剂量依赖性上调人体肠道微血管内皮细胞中CD40 的表达[13]。另有研究显
示，，2 ng/ml 的TNF-α 刺激人脐静脉内皮细胞48 h 后可显着上调CD40 的表达[14]。本实验
的研究结果显示，TNF-α 时间剂量依赖性上调3T3-L1 脂肪细胞中CD40 基因和蛋白表达。
上述结果表明，CD40 作为一个炎症因子高度表现在各种炎症过程中。最近的研究表明，
SIRT1 可通过调节IL-6、ROS 和H2O2 等炎性细胞因子的表达在肥胖相关的心血管疾病中发
150 挥积极有益的作用[15,16]。本实验研究结果显示，SIRT1 激动剂白藜芦醇可以显著下调3T3-L1
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