Cdk5、p35 和p53 基因在砷诱导的神经细胞
凋亡中的改变#
张红梅1，李新2，牛侨1*
基金项目：教育部博士点新教师基金（项目编号：20091417120003）
作者简介：张红梅，（1680-），女，副教授，主要研究方向：神经毒理学. E-mail: zhhm_108@163.com
5 （1. 山西医科大学公共卫生学院， 太原 030001；
2. 太钢疾病预防控制中心，太原 030003）
摘要：【目的】研究cdk5、p35 和p53 基因表达在As2O3 诱导的神经细胞凋亡中的作用，为
探讨As2O3 神经毒性的机制提供一定的基础资料。【方法】原代培养的大鼠神经元，分为空
白对照组、DMSO 溶剂对照组、1、5、10 μM As2O3 组，分别用0、1、5、10 μM As2O3 溶液
10 （DMSO 配制）染毒，空白对照组只加入培养液。染毒8h 后，MTT 法检测神经细胞活力的改
变，用流式细胞仪检测神经细胞凋亡率，实时荧光定量PCR 法检测cdk5、p35、p53 基因的
表达。【结果】随着As2O3染毒剂量的增加，细胞活力逐渐降低，细胞凋亡率逐渐增加，cdk5、
p35 和p53 基因表达逐渐升高。【结论】cdk5、p35 和p53 可能参与As2O3 诱导的神经细胞凋
亡。
15 关键词：三氧化二砷；细胞凋亡；cdk5；p35；p53
中图分类号：R114
 35 0 引言
砷具有中枢神经毒性，能引起人群和动物的行为异常和智力障碍[1，2]，也能使子代神经
系统的发育受影响[3]，能引起神经细胞凋亡[4]，但是作用机制还不十分清楚。Cdk5 和p35
在中枢神经系统的生理和病理过程中起重要的作用。p35 为cdk5 在中枢神经系统特有的激
活剂，cdk5 只有通过与p35（或p35 的降解产物p25）结合并被激活后，参与中枢神经系统
40 的发育、分化、轴突的生长等重要的生理和病理过程。p53 是特异性参与神经细胞的凋亡过
程。本研究以原代培养的大鼠神经元为研究对象，观察As2O3 染毒后细胞活力、细胞凋亡以
及cdk5、p25 和p53 基因表达的影响，为探讨As2O3 对神经细胞的损害机制提供一定的科学
依据。
 1 材料与方法
45 1.1 材料
As2O3，购自sigma 公司，用DMSO 配制成100 μmol/L 的母液，使用时用DMEM 培养
基稀释成相应浓度的工作液。MTT 购自sigma 公司，用PBS 配制成5 mg/ml 的应用液。Trizol
试剂购自北京康为生物公司，细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物。反转录试剂盒和荧光定量
PCR 试剂盒购自北京天根公司。
50 1.2 方法
1.2.1 大鼠神经细胞的培养与染毒
取出生1~3 天的大鼠乳鼠，无菌条件下迅速分离脑组织，剪碎，用0.25%的胰酶消化成
单细胞悬液，并用含10% 胎牛血清的DMEM 完全培养液终止消化。经200 目尼龙网过滤
后用D-hank’s 液漂洗2 次，每次2000 g/min×5 分钟。将分离的细胞用DMEM 完全培养液（37
55 ℃，5% CO2）培养24 小时，加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长，5 天后取对数生长期的细
胞做染毒及后续研究。
1.2.2 细胞活力的检测
采用MTT 法。将神经细胞以每孔1×106 的数目接种在96 孔板中培养。根据预实验的结
果（见图1），确定染毒剂量和时间。在细胞对数生长期染毒，将细胞分为空白对照组（仅
60 加培养液）、溶剂对照组（DMSO），1，5，10 μM 的As2O3 组，每组设3 个复孔。在培养
液中添加不同浓度的As2O3 溶液，于37℃、5% CO2 培养箱中分别培养8h 后，每孔中分别
加入MTT 20 μL (5 mg/mL)，在37℃，5% CO2 培养箱中孵育4h，弃去上清液，加入二甲基
亚砜 (DMSO) 200μL 溶解甲臜结晶。充分打匀，使甲臜结晶完全溶解后在酶标仪492 nm 处
读取吸光度A 值。用A 值大小表示细胞活力的大小。细胞活力抑制率用如下公式计算：
65 细胞活力抑制率(%) =〔(对照孔A 值-实验孔A 值) /对照孔A 值〕×100 %
1.2.3 细胞凋亡的检测
处于对数生长期的神经细胞，经不同浓度的As2O3 染毒8h 后，吸弃培养液终止染毒。
用PBS 漂洗1~2 次，用0.25 %的胰蛋白酶2 min，含DMEM 完全培养液终止消化。加入PBS
轻轻吹打并收集细胞于离心管中；4℃ 2000 r/min 离心10 min，弃上清液后，细胞重悬于300
70 μl Binding Buffer，再加入5 μl AnnexinⅤ-FITC 和5μl PI 染液，轻轻混匀，37℃避光孵育20
min，1h 内上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm，发射波长为525 和605 nm。每个染毒
剂量设三个平行样，每个样品测定104 个细胞。
1.2.4 mRNA 的提取及cDNA 的合成
接种在6 孔板上的神经细胞染毒处理8h 后，弃上清，用PBS 清洗细胞2 次。加入0.5 ml
75 trizol 试剂，按照说明书操作提取RNA。用紫外分光光度计测定RNA 纯度，即测定RNA 光
密度 (OD)，满足OD260 值/OD280 值为1.6。参照试剂盒说明书将总RNA 进行反转录，合
成 cDNA，-20℃保存备用。
1.2.5 实时荧光定量PCR
按照试剂盒说明书操作，进行荧光定量PCR 检测，以β-actin 为内参。每次扩增设置平
 80 行样品。引物由宝生物工程（大连）有限公司设计与合成，引物序列及扩增产物的信息见表
1。
表1 cdk5、p35 和p53 基因的引物序列及相关信息
Table 1 Primers’ sequence and relative information of cdk5, p35 and p53 gene
基因名称 引物序列 Tm值 产物片段
Cdk5 F: 5’-GACCTGGACCCTGAGATTGTGAA-3’
Cdk5 R: 5’-GGTCCCTGTGCAGCACGTTA-3’ 62℃ 91 bp
P35 F: 5’-AAAGGCCACACTGTTTGAGGATG-3’
P35 R: 5’-CTTCCAAGGCAGTACCGAGATGA-3’ 62℃ 124 bp
P53 F: 5’-TCCAGTTCATTGGGACTTATCCTTG-3’
P53 R: 5’-GCTCGATGCTCATATCCGACTG-3’ 64℃ 157 bp
85
扩增条件：首先95℃ 30s，接着95℃ 5s，62℃（Cdk5 和p35 基因）或者64 ℃（p53 基
因）30s，共40 个循环，然后95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s 结束扩增。
目的基因的数量用相对定量的方法来表示。先分别获得对照组和实验组目的基因、内参
基因的平均的Ct 值。ΔCt(1) = (实验组目的基因Ct 值-实验组内参基因Ct 值) ；ΔCt (2) = (对
90 照组目的基因Ct 值-对照组内参基因Ct 值) ；ΔΔCt =ΔCt(1) -ΔCt (2)。实验组目的基因相对
于对照组目的基因的量用2-Δ ΔCT 求得。
1.2.6 统计分析
所有实验数据以( x ± s )表示，采用SPSS11.5 统计软件包处理数据，多组间比较采用方
差分析，组间两两比较采用LSD 法。
95 2 结果
2.1 细胞活力的测定结果（见图1）
图1 结果显示，不同浓度的As2O3 对神经细胞活力均有一定的抑制作用，抑制作用具
有时间和剂量依赖性。结合实验时间的安排，选定的染毒条件为：空白对照、DMSO 溶剂
对照组、1、5、10 μM As2O3 溶液染毒8h。1、5 和10 μM As2O3 染毒8h 对细胞活力的抑制
100 率分别为27.35%、57.16%和73.42%，符合细胞毒性试验对细胞活力的要求。
图1 细胞活力随As2O3 染毒剂量和时间改变的变化
Figure 1 changes of cell viability with As2O3 administration dose and time
105
2.2 细胞凋亡的检测结果（见图2）
As2O3 诱导的神经细胞凋亡率随染毒剂量的增加逐渐增高。图2 所示，与对照组相比，
 1、5 和10 μM 的As2O3 均能诱导神经细胞凋亡，5 μM 和10 μM As2O3 组的神经细胞凋亡率
显著高于空白组和溶剂对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
110
图2 As2O3 诱导的神经细胞凋亡结果图
（*指与对照组相比，P＜0.05）
Figure 2 results of As2O3-induced neural cell apoptosis
(* means that compared to the controls, P＜0.05)
115
2.3 cdk5、p35、p53 基因表达的结果（见表2）
表2 的实时荧光定量PCR 检测结果显示，As2O3 染毒组神经细胞cdk5、p35、p53 基因
表达量都明显升高。与空白对照组相比，DMSO 溶剂对照组的基因表达略有升高，cdk5、
p35、p53 基因的表达量随着染毒剂量的升高而增加，1、5 和10 μM As2O3 染毒组cdk5 是对
120 照组的1.17、1.32 和1.55 倍，p35 是对照组的1.09、1.11 和1.28 倍，p53 是对照组的1.55、
1.73 和2.24 倍。详见表1。
表2 神经细胞cdk5、p35、p53 基因相对表达量
Table 2 Relative gene expression of cdk5, p35, p53 in neural cell
组别 cdk5 p35 p53
空白组 1 1 1
DMSO 组 1.02 1.06 1.15
1 μM 组 1.17 1.09 1.55
5 μM 组 1.32 1.11 1.73
10 μM 组 1.55 1.28 2.24
125
3 讨论
Cdk5 为细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinase，cdk) 家族成员，既
非细胞周期素依赖，也不调节细胞周期，被称为不典型性周期素依赖的蛋白激酶。神经系统
是cdk5 最主要的富集组织。通常情况 cdk5 以单体形式存在，只有与调节因子p35 或p39
130 结合才表现激酶活性，p35 在中枢神经系统特异表达，主要分布于大脑皮层，称作神经元cdk5
的激活剂[6]，而p39 主要分布于小脑。因此cdk5 激酶激活主要限于中枢神经系统。成年动
物大脑是唯一含大量激活型cdk5 的组织[5]。Cdk5 在中枢神经发育、神经元迁移、分化和神
经突起生长等方面均起重要作用。Cdk5 功能异常可导致神经系统功能障碍。p35 的半衰期
仅20～30 分钟，不稳定，能够被泛素激活蛋白酶裂解成p25 和另一大小为10kD 的片段，
135 p25 比p35 片段小，但半衰期比p35 长5～10 倍，毒性远大于p35，对cdk5 有延长激活的作
 用[6]；而且缺乏肉豆蔻酰膜锚定信号基序，致使被激活的cdk5 激酶广泛分布于细胞质中，
无节制地磷酸化胞质的适宜底物如p53 蛋白[7]，稳定p53 的结构和活性，引发病理性改变和
神经毒性[8]。
本研究发现As2O3 能使神经细胞的细胞活力下降，呈现剂量和时间依赖性。As2O3 诱导
140 的神经细胞凋亡率和cdk5、p35、p53 基因表达的改变随着染毒剂量的增加而逐渐升高。有
报道称，分别转染cdk5、p35、cdk5/p35 质粒的神经细胞凋亡率显著增加[9]，提示cdk5/p35
与神经细胞凋亡有关。闫明等人研究发现，激活cdk5 激酶可能通过磷酸化适宜的底物引起
细胞凋亡[10]。As2O3 诱导的细胞凋亡与p53 激活有关[9, 11]。本研究结果提示，As2O3 诱导神
经细胞凋亡过程中，伴有cdk5、p35 和p53 基因表达增加，提示cdk5 激酶激活后可能通过
145 磷酸化p53 蛋白并介导了As2O3 诱导的神经细胞凋亡。本研究仅从基因的改变进行了探索，
真正发挥生物学作用的还是相应的蛋白质，因此，具体的机制有待于进一步深入探讨。