内质网应激在维生素E 琥珀酸酯诱导人胃
癌细胞凋亡中的作用#
黄晓莉，赵艳，吴坤**
基金项目：教育部高等学校博士点基金（200802260017）
作者简介：黄晓莉，（1983-），女，博士，主要研究方向：肿瘤的化学预防
通信联系人：吴坤，（1944-），女，教授，主要研究方向：肿瘤的化学预防. E-mail: wukun_15000@126.com
5 （哈尔滨医科大学营养与食品卫生学教研室，哈尔滨 150081）
摘要：目的: 探讨内质网应激在维生素E 琥珀酸酯（VES）诱导人胃癌SGC-7901 细胞凋亡过
程中的作用。方法: 分别采用Western Blotting 和RT-PCR 法分析VES 不同剂量和不同作
用时间对GRP78、GRP94 和CHOP 蛋白和mRNA 表达的影响；用RNA 瞬时干扰阻断CHOP 的表达，
再用VES 作用SGC-7901 细胞后，采用DAPI 染色法观察细胞凋亡的改变。 结果: 阳性对照
10 组及20μg/mL VES 组在转录水平上均诱导GRP78、GRP94 和CHOP 的表达，并具有时间依赖
性；在翻译水平上20μg/mL VES 显著增加GRP78 和CHOP 的表达，具有时间依赖关系，GRP94
表达先降低，而后又升高；阻断CHOP 显著降低VES 诱导的细胞凋亡。结论: 内质网应激可
能参与了VES 诱导的SGC-7901 细胞凋亡。..
关键词：内质网应激；维生素E 琥珀酸酯；细胞凋亡..
15 中图分类号：R730.1..
 35 0 引言
维生素E 琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）是维生素E 的衍生物，国内外研究[1; 2]
在不同种系和不同组织来源的肿瘤细胞中证实VES 能够抑制肿瘤细胞生长及诱导肿瘤细胞
凋亡，而VES 抗肿瘤作用的确切机制尚未明确。目前认为VES 发挥抗肿瘤作用主要通过干
扰肿瘤细胞周期进程、促进转化生长因子βs 的分泌与活化及诱导肿瘤细胞凋亡等[3; 4]。
40 内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是在各种生理和病理刺激条件下，未折
叠蛋白或折叠错误的蛋白质积聚于内质网内，内质网稳态受到破坏后发生的一系列分子、生
化反应[5]。内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。本研究拟探讨
 VES 对人胃癌SGC-7901 细胞中内质网应激相关分子表达的影响，旨在阐明内质网应激途径
在VES 诱导SGC-7901 细胞中作用。
45 1 材料与方法
1.1 细胞培养
人胃癌SGC-7901 细胞购自北京市肿瘤研究所，细胞在含有10％小牛血清、10O IU/ml
青霉素、100μg/ml 链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640 培养液中，于37℃ 、5％ CO2
培养箱中常规培养。当细胞密度为80％左右时，改换为2％RPMI 1640 培养液加药处理。
50 1.2 受试物
VES 溶于无水乙醇中，配制成10 mg/ml 的储备液，4℃避光保存，备用。使用时用RPMI
1640 培养液将VES 储备液稀释至所需终浓度，乙醇浓度为0.1％，含0.1％乙醇的培养液为
溶剂对照，并设立衣霉素阳性对照组，衣霉素的终浓度为3μg/ml。
1.3 主要试剂和仪器
55 VES 和DAPI 染料购自Sigma 公司，RPMI 1640 培养液购自Gibco 公司，葡萄糖调节蛋
白78（GRP78）, 葡萄糖调节蛋白94（GRP94）, CHOP 多克隆抗体均购自Cell Signaling 公
司，β-actin 和小分子干扰RNA 的siCHOP 链购自Santa Cruz 公司，RT-PCR 试剂盒购自
TaKaRa。
CO2 培养箱(Sanyo，日本)，低温高速离心机(Beckman，美国)，倒置荧光显微镜(Olympus，
60 日本)，杂交箱(Amersham，英国)，核酸蛋白分析仪(Beckman，美国)，数字凝胶成像系统(Alpha
Innotech，美国)。
1.4 Western blotting
细胞收集裂解后，采用Bio—Rad DC protein assay 测定上清液中蛋白质含量，等量蛋白
上样，经10％SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白低温转移至PVDF 膜上，封闭液封闭2h 后，
65 分别加入一抗和二抗，显色。
1.5 逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)
细胞收集后，用Trizol 法提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录。β-actin：上
游5’-GTGGGCCGCTCTA GGCACCAA-3’，下游5 ’ -CTCTTTGATGTCACGCACG
ATTTC-3’，扩增产物为540bp； GRP78：上游5’- GATAATCAACCAACTGTTAC -3’，
70 下游5’- GTATCCTCTTCAC CAGTTGG-3’，扩增产物为577bp； GRP94：上游5’-
CAGTTTTGGATCTTG CTGTGG-3’，下游5’- CAGCTGTAGATTCCTTTGC -3’, 扩增产
物为274bp；CHOP：上游5’- GCACCTCCCAGAG CCCTCACTCTCC -3’ ，下游5’-
GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG -3’，扩增产物为422bp。反应条件：95°C 预变性
5min；94°C 变性30 s, 56°C 退火30 s, 72°C 延伸30 s，36 个循环。PCR 产物经2%琼脂糖
75 凝胶电泳及溴化乙啶染色、拍照。
1.6 RNA 瞬时干扰
将对数生长期的细胞按2×105 个/ml 的密度接种至6 孔板中，37℃ 、5％CO2 温育过夜。
待细胞密度为30%-50%时，按照X-tremeGENE siRNA 转染试剂说明书进行操作。将siCHOP
 和阴性干扰RNA 链各15μl 置于85μl Opti-MEM（r）I Reduced Serum Medium 培养液中，
并将10μl X-tremeGENE siRNA 转染试剂置于90μl Opti-MEM（r）80 I Reduced Serum Medium
培养液中，把上述含siRNA 的培养液与含X-tremeGENE siRNA 转染试剂的培养液混合，加
入细胞中。
1.7 DAPI 染色
细胞处理、收集后，加入2μg/ml DAPI 无水甲醇溶液，37°C 孵育15min，PBS 冲洗2
85 次，滴片，在300-500nm 紫外波长下用倒置荧光显微镜进行观察。
2 结果
2.1 VES 对人胃癌细胞内质网应激相关分子蛋白表达的影响
不同剂量VES 作用SGC-7901 细胞24h 及20μg/mlVES 作用不同时间后，采用Western
blotting 法检测GRP78、GRP94 和CHOP 蛋白的表达（图1 和图2）。结果表明，不同剂量
90 VES 作用胃癌细胞后，GRP78 和GRP94 蛋白均呈现先降低又增高的趋势，而且20μg/mL VES
对GRP78 蛋白的诱导作用具有时间依赖性，但VES 作用胃癌细胞不同时间后， 先降低
GRP94 蛋白的表达，而后又有所回升。同时，不同剂量VES 及作用SGC-7901 细胞不同时
间后，CHOP 蛋白的表达均显著增加。
95
图1 不同剂量VES 作用胃癌SGC-7901 细胞24h 后内质网应激相关分子蛋白表达
Figure 1 Effect of VES on the protein expression of endoplasmic reticulum stress related indicators at different
100
doses for 24h in the SGC-7901 cells
105
110
0 5 10 20 TM μg/ml
GRP78
GRP94
CHOP
β-actin
 图2 20μg/ml VES 作用胃癌细胞不同时间后内质网应激相关分子蛋白表达
120 Figure 2 Time-dependent effect of 20μg/ml VES on the mRNA expression of endoplasmic reticulum stress related
indicators in the SGC-7901 cells
2.2 VES 对人胃癌细胞内质网应激相关分子mRNA 表达的影响
不同剂量VES 作用SGC-7901 细胞24h 及20μg/mlVES 作用不同时间后，采用RT-PCR
125 法检测GRP78、GRP94 和CHOP mRNA 的表达（图3 和图4）。结果表明，阳性对照组及
20μg/mL VES 组在转录水平上均诱导GRP78、GRP94 和CHOP 的表达，并具有时间依赖性。
同时，VES 对CHOP 的诱导作用还具有剂量依赖关系。
130
图3 不同剂量VES 作用胃癌细胞24h 后内质网应激相关分子mRNA 表达
Figure 3 Effect of VES on the mRNA expression of endoplasmic reticulum stress related indicators at different
135
doses for 24h in the SGC-7901 cells
0 6 12 18 24 h
GRP78
GRP94
CHOP
β-actin
0 5 10 20 TM μg/ml
GRP78
GRP94
CHOP
β-actin
 145 图4 20μg/mlVES 作用胃癌细胞不同时间后内质网应激相关分子mRNA 表达
Figure 4 Time-dependent effect of 20μg/ml VES on the mRNA expression of endoplasmic reticulum stress related
indicators in the SGC-7901 cells
2.3 阻断CHOP 对细胞凋亡的影响
150 采用RNA 干扰方法阻断胃癌细胞CHOP 的表达。结果显示细胞经RNA 干扰36h，再
用20μg/mlVES 处理18h 后，干扰组与VES 处理的未干扰组相比，细胞CHOP mRNA 水平
明显降低（图5）。
155
图5 VES 作用胃癌细胞后RNA 干扰对CHOP mRNA 表达的影响
A：对照组；B：阴性干扰RNAi+VES 组；C：siCHOP RNAi+VES 组
Figure 5 The mRMA expression of CHOP after RNA interference
A: control group; B: negative RNAi + VES group; C: siCHOP RNAi + VES group
160
细胞经RNA 干扰36h，再用20μg/mlVES 作用24h，进行DAPI 染色（图6）。结果显
示：空白对照组细胞无凋亡；经VES 作用的阴性干扰组其细胞凋亡率为46.3%；经VES 作
用的siCHOP 干扰组其细胞凋亡率为27.9%。由此可见，VES 诱导SGC-7901 细胞凋亡过程
中，CHOP 阳性表达细胞的凋亡率显著高于CHOP 阴性表达细胞。
165
0 3 6 9 12 15 18 24 h
GRP78
GRP94
CHOP
β-actin
CHOP
β-actin
A B C
 图6 VES 作用胃癌细胞后阻断CHOP 对细胞凋亡的影响
A：对照组；B：阴性干扰RNAi+VES 组；C：siCHOP RNAi+VES 组
Figure 6 Effect of CHOP on the apoptosis in the VES-treated SGC-7901 cells
175 A: control group; B: negative RNAi + VES group; C: siCHOP RNAi + VES group
3 讨论
内质网是真核细胞重要的亚细胞器，参与重要的生理功能，低氧、葡萄糖饥饿、糖基化
紊乱和氧化、药物作用、紫外线等刺激均可诱发细胞发生内质网应激。此时，细胞会启动未
180 折叠蛋白反应( unfolded protein response, UPR)，以保护由ERS 引起的细胞损伤，包括降低
蛋白质合成速率、上调内质网伴侣蛋白表达等[6]。但是，如果ERS 损伤过于严重和持久，
UPR 同样能够启动ERS 介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡[5]。
GRP78 和GRP94 是葡萄糖调节蛋白的主要成员，分布在内质网腔内，具有内质网标志
性分子伴侣的功能，常作为内质网应激的标志物。研究表明，GRP78 和GRP94 可结合未折
185 叠的多肽链、协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运、抑制蛋白质聚集，并降低错误折叠蛋白
质的分泌，促进细胞存活[7]。Yan Y 等发现白藜芦醇诱导人淋巴瘤细胞发生内质网应激和凋
亡过程中GRP78 和GRP94 表达增高[8]。Sheu ML 等研究报道不同剂量和厚朴酚处理人胃癌
细胞可引起内质网应激，并降低GRP94 的表达[9]。这些研究提示我们，各种刺激诱导细胞
发生内质网应激时，GRP78 和GRP94 表达增高，以恢复细胞稳态；而在刺激过强、内质网
190 应激诱导凋亡时，它们的表达反而降低。本研究发现20μg/mL VES 能够诱导胃癌SGC-7901
细胞GRP78 和GRP94 mRNA 表达，具有时间依赖关系，在翻译水平上GRP78 蛋白的表达
与mRNA 基本一致，表明VES 诱导SGC-7901 细胞发生内质网应激；而5、10μg/mL VES
作用胃癌细胞24h 及20μg/mL VES 作用6、12、18h 时，GRP94 蛋白与对照组相比表达明显
降低，又提示内质网应激可能参与VES 诱导的胃癌细胞凋亡。
195 CHOP／GADD153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153)即生长阻滞和
学术论文网Tag：代写论文 论文发表 代发论文 职称论文发表 医学论文代写